白木香品种‘热科2号’沉香化学成份的GC-MS分析①

王宇光 王 军 杨锦玲 蔡彩虹 盖翠娟 梅文莉 戴好富

(中国热带农业科学院热带生物技术研究所/海南省沉香工程技术研究中心 海南海口571101)

沉香是中国、日本、印度以及其他东南亚国家的传统名贵药材，在中医中作为组方配伍，应用于消化、呼吸、心脑血管等疾病的治疗［1］。沉香具有神经保护、镇痛、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、解痉、降血糖、治疗过敏及改善慢性肾衰竭等作用［2-8］；其次，沉香的香料价值较高，被世界五大宗教（佛教、道教、伊斯兰教、回教和天主教）所用。从沉香中提取的精油在中东国家备受消费者青睐，近年来，在化妆品等日用品方面得到广泛应用；第三，沉香工艺品具有文化收藏价值，其经济价值可观。因此，沉香产业有很好的发展前景［9］。

由于野生资源的枯竭，自20 世纪80 年代，世界各个国家开始重视沉香植物的人工栽培。目前，在中国（广东、海南、广西和云南等省区）、马来西亚、越南等东南亚国家均大量种植沉香植物。国产沉香的基源植物为白木香［Aquilaria sinensis（Lour.）Spreng.］，关于白木香优良品种系统选育的报道较少。目前，白木香种子苗未经过系统筛选，种质参差不齐［10］。因此，加强种质资源的调查，开展优良品种选育，通过无性繁殖技术来培育易产香、产量高、品质好的优良品系［11］，对沉香产业的发展有着重要的现实意义。

中国热带农业科学院热带生物技术研究所在前期分别筛选了2个白木香优良嫁接无性系“热科1 号”（琼R-ETS-AS-010-2016） 和‘热科2 号’（琼R-ETS-AS-003-2017），杨锦玲等［12］已报道了‘热科1号’所产沉香的化学成份，但关于‘热科2号’所产沉香的化学成份方面未见报道。沉香中的特征性成分主要为2-（2-苯乙基）色酮和倍半萜2类化合物［13-14］，但不同白木香品系生产的沉香的化学成分存在较大差异。本文采用GC-MS技术分析‘热科2号’所产沉香的化学成分，以期获得对‘热科2号’的评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

色谱-质谱（GC-MS）联用仪，型号为HP6890/5975C GC/MS，美国安捷伦公司制造；色谱柱为弹性石英毛细管柱HP-5MS 5%Phenyl Methyl Siloxane （30 m×0.25 mm×0.25 μm）；称量使用万分之一电子秤，型号为BP221S，由北京赛多利斯天平有限公司生产；萃取均质用美国BRANSONIC-5510E-DTH 超声波清洗仪。气质中使用的试剂均为分析纯。

1.1.2 试剂

GC-MS 中使用的试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.3 样品

均采自中国热带农业科学院热带生物技术研究所‘热科2 号’试验基地。‘热科2 号’植株树龄为5年。结香方法：砍伤法。结香部位：树干中部。结香时间：2 年。分别从‘热科2 号’树干上砍伤所致结香部位挑取样品放入塑料密封样品袋中，每棵树取一份样品，编号为S1-S17。同时取同地点同树龄和同样结香的普通白木香沉香样品为对照，记为普通白木香沉香样品（简称普，S0）。凭证标本均存放于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

分别精确称取各沉香样品3.000 0 g，分别用50 mL 乙醚在冰水浴下超声萃取30 min，静置5 min后过滤得到乙醚提取液。重复提取3 次，合并3 次提取液。

1.2.2 GC-MS分析

质谱条件：电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；接口温度280℃；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 434 V；质量扫描范围20～550 m/z。对总离子流图中的各峰经质谱数据系统检索及核对Nist 2005和Wiley 275 标准质谱图，并借鉴前人和本研究组前期的鉴定方法［14］，比对鉴定化合物。

色谱条件：色谱柱为弹性石英毛细管柱HP-5MS 5%Phenyl Methyl Siloxane （30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：柱温50℃，保持2 min，以5℃/min 升温至310℃，保持10 min；汽化室温度250℃；载气为高纯He（99.999%）；载气流量1.0 mL/min；不分流；溶剂延迟时间：3.0 min。

1.2.3 GC-MS指纹图谱的建立与分析

参照杨锦玲等［15］的方法，将17 个样品（S1-S17）的GC-MS 总离子流图转换成文本格式，导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A 版”软件中，设定S17 为参照图谱，选取“时间窗宽度”为0.1 min，经多点校正，自动匹配，建立GC-MS指纹图谱，并对不同样品的共有成份和指纹图谱特征进行分析。

2 结果与分析

2.1 白木香品种‘热科2号’沉香样品的化学成份

从GC-MS 分析的总离子流图谱来看，‘热科2号’所产沉香样品（如图1-S1、1-S2）的图谱在保留时间25～35 min.出现了面积较小的色谱峰，而在保留时间39～44 min.出现了面积较大的色谱峰。前者主要被检测为倍半萜，而后者主要被检测为色酮化合物，具体成份详见表1。从表1可知，‘热科2 号’沉香样品中鉴定的倍半萜和色酮相对百分含量之和平均分别为2.35%和93.18%，后者比前者明显提高。其中被检测到的倍半萜类化合物包括新紫蜂斗菜烯、枯树醇、α-木香醇、4-羟基白木香醇、二氢卡拉酮、白木香醛、2，t-3-二甲基-2-（3-甲基-2-丁烯基）-1-环己酮、瓦伦萨-1（10），8-11-醇、7α-H-9（10）-烯-11，12-环氧-8-氧艾里莫芬烷、（-）-愈创木-1（10），11-二烯-15-醛、桉- 5.11（13）8.12 二烯内酯、9-羟基-芹子-3，11-二烯-14-醛、11-羟基-瓦伦萨-1（l0）-烯-2-酮，等，这些倍半萜类化合物在白木香沉香中较为常见，在‘热科2号’沉香样品中的相对含量较低。

在‘热科2号’所产沉香样品中检测到的色酮类化合物包括两种类型：一种为5，6，7，8 位没有取代基的色酮，相对含量较高，主要为2-（2-苯乙基）色酮、2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮、2-［2-（3-羟基-4-甲氧基苯）乙基］色酮和2-［2-（3-甲氧基-4-羟基苯）乙基］色酮，这4个色酮相对含量之和为88.97%～98.51%，平均为93.16%，其中2-（2-苯乙基）色酮和2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮的相对含量之和平均高达64.01%；另外一种类型为5，6，7，8 位有取代基的色酮，相对含量较低，包括6-甲氧基-2-（2-苯乙基）色酮、6-羟基-2-（2-苯乙基）色酮、6-甲氧基-2-［2-（3-甲氧基-4-羟基苯）乙基］色酮、6-甲氧基-2-［2-（3-羟基-4-甲氧基苯）乙基］色酮、6-羟基-2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮、6-甲氧基-2-［2-（3-甲氧基-4-甲氧基苯）乙基］色酮、6-甲氧基-7-羟基-2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮等，这部分色酮的相对含量较低（分别为0.5%以下）。与‘热科2 号’所产沉香样品显著不同，作为对照的普通白木香沉香样品（图1-S0）的GC-MS 分析的总离子流图谱中，在保留时间20～35 min。出现了较多面积较大的色谱峰，而在保留时间42～45 min。出现了面积较少的色谱峰，前者主要被检测为倍半萜，相对百分含量之和为49.6%，而后者主要被检测为色酮化合物，其相对百分含量之和为5.02%，前者比后者明显提高。其中被检测到的倍半萜类化合物种类和与‘热科2号’所产沉香样品相差不大，但相对含量较‘热科2 号’所产沉香样品显著提高。相反，普通白木香沉香样品中检测到的色酮类化合物为5，8-二羟基-2-（2-苯乙基）色酮和2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮，种类少而且色酮的相对含量较低（5.02%）。因此，‘热科2 号’所产沉香样品的化学成份和对照的普通白木香沉香样品有明显差异。

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2.2 白木香品种‘热科2 号’所产沉香的GC-MS 指纹图谱

考察‘热科2 号’17 个不同的沉香样品GC-MS指纹图谱的相似度（图2），发现其数值很高。其中，S6 和其它样品间为0.55～0.95，其它样品在0.70～0.99（表2）。各样品GC-MS指纹图谱具有一个共同特征：即在保留时间39～44 min 出现了面积较大的4 个相同色谱峰。这4 个色谱峰被鉴定的相应的化合物按保留时间先后顺次分别为为2-（2-苯乙基）色酮、2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮、2-［2-（3-甲氧基-4-羟基苯）乙基］色酮和2-［2-（3-羟基-4-甲氧基苯）乙基］色酮。这说明‘热科2号’不同个体所产沉香样品的化学成份具有较好的一致性，但同时这4种色酮在不同的样品中的相对含量存在着不同程度的变化（图3）。

各个样品中相对含量最高而且最为稳定的色酮是2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮（相对含量为29.49%～67.43%，平均为48.96%），其次为2-［2-（3-羟基-4-甲氧基苯）乙基］色酮（相对含量为7.11%～47.12%，平均为22.18%），2-（2-苯乙基）色酮（相对含量为0.60%～29.14%，平均为15.05%）和2-［2-（3-甲氧基-4-羟基苯）乙基］色酮（相对含量为1.17%～16.88%， 平均为6.97%）。因此，‘热科2 号’所产沉香的化学成分的分布有着显著的特征。

表2 ‘热科2号’不同沉香样品GC-MS指纹图谱相似度

3 讨论

从GC-MS 分析结果来看，‘热科2 号’所产沉香包含的2-（2-苯乙基）色酮类化合物的相对含量较高，其主要特征性成份物质为2-（2-苯乙基）色酮、2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮、2-［2-（3-羟基-4-甲氧基苯）乙基］色酮和2-［2-（3-甲氧基-4-羟基苯）乙基］色酮，不同样品化学成份的GC-MS指纹图谱的相似度较高。这些数据说明该白木香品种所产沉香在化学成份方面具有明显特征。

沉香的特征性化学成分，主要包括倍半萜和色酮类化合物。已从沉香中分离鉴定了136个倍半萜化合物结构和128 个色酮类化合物的结构［16］。倍半萜类化合物具有沉香呋喃类、桉叶烷类、艾里莫芬烷类、沉香螺烷类和愈创木烷类等多种结构类型；2-（2-苯乙基）色酮类衍生物可分为5，6，7，8-二环氧-2-（2-苯乙基）色酮、5，6-环氧-2-（2-苯乙基）色酮、5，6，7，8-四氢-2-（2-苯乙基）色酮、2-（2-苯乙基）色酮四种类型［16］。因此，沉香的化学成分种类非常丰富。从分析结果来看，‘热科2 号’所产沉香的化学成分以2-（2-苯乙基）色酮衍生物为主。不同类型的沉香，其化学成份的差异主要体现在倍半萜和色酮类化合物的相对含量以及具体的化合物组成方面。研究表明，不同白木香品种所产的沉香的化学成分大致存在3 种类型：一是包含较高的倍半萜，而色酮类化合物含量较低；二是包含的倍半萜和色酮类化合物含量相当；三是包含较低的倍半萜，而色酮类化合物含量较高［15］。除了这3 种类型外，还可能存在着中间类型。从分析结果来看，‘热科2 号’所产沉香属于第3 种类型。而“热科1号”所产沉香属于第二种类型［12］。

从海南、广东、广西、云南等地共取10 批白木香沉香样品进行化学成分GC-MS 指纹图谱分析［15］，发现共有成份中，倍半萜主要为白木香醛、ent-4 （15） -eudesmen-11-ol-1-one、 11-hydroxy-valene-1（10）-en-2-one；色酮类化合物为2-（2-苯乙基）色酮、5，8-二羟基-2-（2-苯乙基）色酮、6-羟基-2-（2-苯乙基）色酮、6，7-二甲氧基-2-（2-苯乙基）色酮、5，8-二羟基-2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮、6-羟基-2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮、6，7-二甲氧基-2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮，除了2-（2-苯乙基）色酮外，都是5，6，7，8 位有取代的色酮。‘热科2 号’所产沉香化学成分GC-MS 指纹图谱的共有成份中，倍半萜主要为白木香醛，与前人的研究结果相似。而色酮类化合物主要为4种在5，6，7，8 位没有取代的色酮，而且相对含量较高，成份较为集中，其分布与前人的研究结果有显著的差异。这说明‘热科2号’在所产沉香化学成分方面，与普通白木香不同，有突出的品种特征。

影响沉香化学成分多样性的因素主要为品种的遗传特性。白木香组织和细胞在受到物理、生物或化学等因子的伤害胁迫后才逐渐形成特征性化学成份［17-20］。其过程包括伤害信号的识别、传导［21］和倍半萜和2-（2-苯乙基）色酮类化合物合成相关基因的表达等［22-26］。倍半萜和色酮类是两种结构上差异较大的化合物，它们通过不同的代谢途径合成。由于不同种质的基因组成和表达调控的差异，导致最后形成的沉香的化学成份多样性。‘热科2 号’可能具有较突出的色酮类化合物的合成代谢通路的相关基因构成，同时这些基因在受到物理、生物或化学等因子的伤害胁迫后获得较高的表达，而目前的研究表明，一些普通白木香品种受到伤害胁迫后，主要为倍半萜合成代谢通路的相关基因上调表达［27］，这为进一步研究白木香色酮类化合物的合成代谢通路提供了基础。通过1～12 个月的动态研究表明，‘热科2 号’ 树种在受伤害诱导后倍半萜等合成较少，主要合成2- （2- 苯 乙 基） 色 酮（2- （2-phenylethyl）chromones，PECs）类化合物，同时环氧-2-（2-苯乙基） 色酮（PECs with epoxidated chromone moiety）的合成较少，推测2-（2-苯乙基）色酮生物合成是由III 型聚酮合成酶（PKSs） 催化介导［28］。

‘热科2号’不同沉香样品的化学成份的差异，主要表现在以上4种特征性成份物质的相对含量存在较大的变化。因而，其GC-MS指纹图谱存在一定的变化。由于在结香过程受到土壤因子、气候因子、微生物等多种环境因素的影响，因而所形成的不同沉香样品的化学成份有所差异。有研究表明，同一白木香树杆因不同的结香方法形成的沉香的化学成份也可能存在差异［29］。因而，沉香的化学成分的形成除了受到遗传因子的影响外，还受到环境因子的作用，但主成分决定于品种的遗传属性［30］。其中，2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮的相对含量变化较小，说明它们受遗传力的影响更大。

“奇楠”沉香和越南红土沉香是目前业内一致认可的优质天然沉香，研究表明这些沉香的乙醚萃取物中的2-（2-苯乙基）色酮类化合物的相对含量也较高，其中2-（2 苯乙基）色酮与2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮这2 个化合物的相对含量之和达51.57%～84.71%［31-33］。‘热科2 号’所产沉香中2-（2-苯乙基）色酮与2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮的相对含量之和平均为64.01%，说明其具有优质沉香的主要成份。但除了这2种色酮外，‘热科2号’所产沉香的2-［2-（3-羟基-4-甲氧基苯）乙基］色酮和2-［2-（3-甲氧基-4-羟基苯）乙基］色酮的相对含量也较高，这说明其色酮种类更多，有别于传统的“奇楠”沉香和越南红土沉香。2-（2-苯乙基）色酮类化合物是沉香中高沸点香气成份，这些成份显著提高沉香香气的沉稳性。研究还表明，2-（2-苯乙基）色酮类化合物受热时，降解为芳香族化合物，对沉香在受热时的发香时间长短、香气组成和变化具有重大贡献［34］。因此，‘热科2 号’所产沉香在作为香料方面具有独特性。另外，2-（2-苯乙基）色酮类衍生物具有不同程度的抗过敏和神经保护方面的活性［34-35］，推测‘热科2号’所产沉香在抗过敏和神经保护方面可能具有相对较好的活性，有待进一步研究。