微生物碳酸酐酶诱导Ca CO3沉淀的影响因素及生成机理

袁亮

（商丘职业技术学院，商丘 476000）

碳在自然界的存在形式很多，最重要的存在形式是碳酸盐和CO2，它们在全球碳循环中具有重要作用，碳酸盐沉积更是在全球碳循环和地质形成与演化过程中的起着决定性的作用［1］。其中碳酸钙在海水或湖水中由于局部过饱和而导致的沉淀是地球表面重要的化学过程之一，这一过程最终导致大量的碳酸盐岩的形成。尽管传统观点将碳酸盐矿物的形成归功于无机过程，但越来越多的证据表明，微生物在其形成过程中起到了极为重要的作用。然而对于微生物诱导碳酸盐沉积的机理尚无统一的认识，因此研究碳酸酐酶的矿化诱导机理对于阐明全球碳循环等科学问题具有重要的意义［2］。

目前大部分文献报道的诱导碳酸钙沉积的微生物是一种能产生碳酸酐酶（Carbonic anhydrase，CA）的细菌［3-5］。1933年，Meldrum和Roughton［6］在牛的血红细胞中首次发现了碳酸酐酶，后来在植物、藻类及微生物中也相继发现了CA的存在。碳酸酐酶是一种含Zn2+的金属酶［7］，在CO2和HCO3-相互转化的可逆反应中起催化作用。然而尽管催化同一化学反应，但其在不同有机体中所起的生理作用存在较大差异，可以涉及离子交换、呼吸作用、pH稳定性、CO2浓缩机制及光合作用的各个方面［8-10］。有实验结果表明，牛的血红细胞［11］、杜氏藻［12］和细菌［13-19］分泌的CA均可以促进碳酸钙的结晶。因此，CA被认为是促进碳酸盐矿化的关键酶之一。在CA诱导矿化的过程中，CA的活性会受到各种因素的影响，如温度、pH值和Ca2+浓度等。因此，研究不同因素对CA活性的影响，为进一步弄清楚CA诱导CaCO3的矿化机理具有重要的意义，近几年来，激起了科研工作者的研究兴趣。

本研究利用菌种库中一种产生胞外碳酸酐酶的CA菌进行一系列实验，通过测试不同反应温度、pH值和Ca2+浓度下的CA活性，研究了不同条件对CA诱导CaCO3的影响，探索出CA加速CO2水合反应的催化机理，旨在为探索CA潜在的应用价值提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

CA菌，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）；蔗糖、酵母浸粉、氢氧化钠（NaOH）、氯化钙（CaCl2），上海凌峰化学试剂有限公司；乙酸对硝基苯酯、二乙基丙二酸，国药集团化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯；蒸馏水，实验室自制。

1.2 方法

1.2.1 微生物的培养 所选育的CA菌，细胞呈粗长杆状，直径1.5-2.2 μm，长4.0-6.4 μm。培养基选用蔗糖和酵母浸粉培养基，其具体成分如下：蔗糖6.0 g/L，酵母浸粉1.0 g/L，蒸馏水1 000 mL，1 mol/L的NaOH溶液调节培养液pH值为7.0，培养基分装于三角瓶中，在12l℃高压灭菌器中灭菌30 min，无菌接种（1% V/V）的菌液于指定温度、120 r/min的恒温振荡培养箱中培养36 h。

1.2.2 微生物细菌数量的测试 恒温振荡培养箱培养36 h后取其上层菌液进行OD400测试，OD400为菌液于波长400 nm下的光密度，OD400是采用多功能酶标仪进行测试的结果，其值越大表示细菌数量越多。

1.2.3 微生物生长及矿化过程中pH值的测定 微生物生长及矿化过程中的pH值测定采用PHS-3C（A）型精密酸度计，精度为0.1。

1.2.4 不同培养温度对微生物生长和碳酸酐酶活性的影响 6.0 g/L蔗糖和1.0 g/L酵母浸粉的培养基（pH7.0）经高压灭菌25 min，无菌接种（1% V/V）的菌液于5、10、15、20、25、30和35℃的温度，120 r/min的转速下，在恒温振荡培养箱中培养36 h后，用多功能酶标仪测不同温度下的OD400值，用显色法测试CA菌碳酸酐酶的活性。

1.2.5 不同初始pH值对微生物生长和碳酸酐酶活性的影响 用1 mol/L的NaOH溶液调节培养基的初始pH值为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，无菌接种（1%V/V）菌液后，在25℃、120 r/min的恒温振荡培养箱中培养36 h，在刚开始的24 h内每隔4 h测试培养基溶液中的pH值变化、OD400值和碳酸酐酶的活性，后12 h每隔6 h测试培养基溶液中的pH值变化、OD400值和碳酸酐酶的活性。

1.2.6 不同Ca2+浓度对微生物生长和碳酸酐酶活性的影响 采用CaCl2作为钙源，设置Ca2+浓度为（mmol/L）0、25、50、75、100、125、150、200和250，无菌接种（1% V/V）菌液后，在25℃、120 r/min的恒温振荡培养箱中培养36 h，测试培养基中上清液的Ca2+浓度、OD400值和碳酸酐酶的活性。其中，Ca2+浓度采用EDTA滴定法滴定。

1.2.7 碳酸酐酶活性的测试 酶活性是指酶催化某一化学反应的能力，酶活性的大小可通过单位时间内催化的某一化学反应的反应物消耗量或产物生成量来表示，可通过比色法来测定［14，20］。碳酸酐酶能够特定催化乙酸对硝基苯酯和二乙基丙二酸的混合液反应，生成对硝基苯酚显色，不同程度的显色可由溶液OD460值表示，根据溶液OD460值可计算出对硝基苯酚生成量，不同活性酶催化效率不同，根据生成的对硝基苯酚量可间接反映酶活性。故要先绘制对硝基苯酚溶液浓度与OD460值关系的标准曲线。

1.2.7.1 标准曲线的绘制 分别配制出不同浓度的对硝基苯酚标准溶液，在波长460 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，并得出直线方程，结果如图1所示。

图1 对硝基苯酚浓度与吸光度的关系

1.2.7.2 工作液的制备 将0. 001 8 g乙酸对硝基苯酯pNPA溶于0.5 mL 无水乙醇中，另将0. 015 6 g二乙基丙二酸用9.5 mL磷酸缓冲溶液溶解，两者混合作为工作液。

1.2.7.3 碳酸酐酶活性的测定 将微生物菌液稀释5倍，采用移液枪移取1 mL微生物菌液和1 mL 工作溶液，混合后放入全波长酶标仪检测箱中，设置检测箱温度为25℃；反应30 min 后，在波长460 nm处测量溶液的吸光度，对照对硝基苯酚浓度与吸光度的关系曲线获得生成对硝基苯酚的量，通过单位时间对硝基苯酚生成量来表征碳酸酐酶的酶活性。酶活性的单位以U来表示。

1.2.8 微生物诱导CaCO3沉积 向250 mL的培养基中加入60 mmol/L的CaCl2，在25℃、120 r/min的恒温振荡培养箱中培养，矿化培养基的成分为1.5 g蔗糖、0.25 g酵母浸粉。用1 mol/L的NaOH调节培养基体系的初始pH值为6.5、、7.5、8.5和9.5，每隔一段时间取出上清液，测试其反应液中的pH值和Ca2+浓度的变化。

1.2.9 微生物矿化产物表征 对所得的沉淀洗涤干燥后，利用X-射线衍射仪（XRD，Dmax-B型，日本理学公司）测定其矿物成分。测定条件：Cu靶，Kα，管压35 kV，管流20 mA，2°/min，步长0.01°，测定范围20°-60°。利用带有元素分析的Sirion场发射扫描式电子显微镜（S-3400）观察沉淀物的形貌并测定其元素组成。

2 结果

2.1 不同温度下CA菌的生长和酶活性的变化

图2是不同温度对CA菌生长和酶活性的影响。从图中可以看出，从低温到高温，随着温度的升高，CA菌的生长繁殖情况和酶活性存在显著差异。在低温下（5℃），CA菌几乎不生长，酶活性也没有，随着培养温度的升高，细菌的生长速度加快，酶活性也得到了相应的提高，在培养温度达到25℃时，CA菌的OD400值和酶活性都达到了最大值，表明25℃是CA菌的最佳培养温度。随着培养温度继续升高，CA菌的生长受到抑制，酶活性也急剧下降，尤其是在35℃的培养温度下，CA菌的生长情况和酶活性大大降低。由此可知，温度是影响CA菌生长和酶活性的重要因素。

图2 温度对CA菌生长和酶活性的影响

2.2 不同初始pH值下CA菌生长和酶活性的变化

随着培养时间的增加，初始pH值为7.0-8.5时培养基体系溶液的pH值先降低后上升，而当初始pH值为9.0和9.5时，溶液的pH值缓慢下降，其结果如图3所示。不同初始pH值下的CA菌的生长和酶活性变化如图4所示，在初始pH为7.0-8.5的范围内，细菌生长繁殖良好，而当pH值升高到9.0以上时，细菌的生长受到严重抑制，当初始pH值高达9.5时，细菌生长大大降低。同时在高pH值下细菌的酶活性也受到严重影响，在初始pH值为7.0-8.5时，细菌的酶活性相差不大，而当初始pH值为9.0时，酶活性下降26%，随着pH值的升高，CA酶活性急剧下降。由此可见，初始pH值能够限制CA菌的生长和酶活性，其最佳的初始pH值为范围7.0-8.5。

图3 不同初始pH值下培养基溶液的pH值随培养时间的变化

图4 不同初始pH值对CA菌生长和酶活性的影响

2.3 不同外加Ca2+浓度下CA菌生长和酶活性的变化

离子浓度会影响微生物细胞周围的渗透压，进而影响微生物的生长情况。不同Ca2+浓度对细菌的生长繁殖和酶活性的影响如图5所示，从图中可以看出，在Ca2+浓度为0-50 mmol/L的范围时，CA菌的OD400值和酶活性相差不大，在Ca2+浓度为50 mmol/L时，细菌的生长情况最好，酶活性也达到最大值。随着Ca2+浓度的增加，CA菌的生长受到抑制，酶活性也逐渐降低，当Ca2+浓度达到150 mmol/L以上时，细菌几乎不生长，酶活性几乎没有。由此可知，当外加Ca2+浓度在0-50 mmol/L时，细菌的生长情况良好，并且此时的碳酸酐酶活性也较好。

图5 不同Ca2+浓度对CA菌生长和酶活性的影响

2.4 CA菌诱导CaCO3的矿化过程

培养液中的pH值在细菌矿化过程中起着重要的作用，在初始pH值为7.5、8.5和9.5的培养基中，加入50 mmol/L的CaCl2溶液，每隔6 h测试溶液中的pH值和Ca2+浓度的变化。图6是不同初始pH值下培养液中的pH值随时间的变化，从图中可以看出，在培养过程中，初始pH值为7.5和8.5的培养液中的pH值总是先降低后升高，这主要是因为培养后期，营养物质消耗完毕，有害代谢产物的积累，造成细菌死亡，细胞自溶，从而导致pH值的升高。而初始pH值为9.5的培养液中的pH值缓慢下降，可能是细菌在高的pH值下无法进行正常生长，溶液pH值下降是大气中的CO2溶解在培养液中所致。图7是培养液中的Ca2+浓度随培养时间的变化，从图中可以看出，Ca2+浓度总是先降低后维持不变，其中培养液初始pH为8.5时，Ca2+浓度下降最快，而后由于细菌的溶解死亡，Ca2+的消耗与溶出达到平衡。Ca2+浓度变化最小的是培养液初始pH值为9.5，此时Ca2+仅仅减少了8 mmol/L，这主要是因为在较低的pH值下，CO2溶于水产生多余的H+会溶解生成的CaCO3，此时CaCO3的生成与溶解达到平衡，故而其Ca2+浓度变化较小。当培养液中的初始pH达到9.5时，此环境下影响了细菌的生长，导致了酶活性的降低，CO2的水合反应受到抑制，故而Ca2+的浓度变化较小。将培养液中的沉淀过滤、洗涤、干燥后，所得CaCO3的质量如图8所示，从图中可以看出，当培养液初始pH值为8.5时，CaCO3的生成量最多，9.5的初始pH值所矿化生成的CaCO3的质量最小。由以上分析可知，pH值能影响CA菌诱导CaCO3的矿化过程，偏低的pH值会使生成的CaCO3溶解，而偏高的pH值会影响CA菌的酶活性，限制CO2的水合反应过程，CA菌最佳的矿化pH值为8.5，此时的CaCO3生成量是最多的。

图6 不同初始pH值下培养液中的pH值随矿化时间的变化

图7 不同初始pH值下培养液中的Ca2+浓度随矿化时间的变化

3 讨论

3.1 温度对CA菌生长和酶活性的影响

图8 不同初始pH值下培养液中所生成的CaCO3

细菌在生长繁殖过程中，都有最适宜的温度范围。当外界温度高于最适温度时，细菌蛋白质、核酸、细胞壁和细胞膜及酶类因热力作用发生变性或凝固，活性消失，代谢发生障碍，从而导致细菌死亡。在低温条件下时，因温度低于最适温度，细菌代谢活动降低，从而不再繁殖，但能较长时间维持生命，此种温度下适用于保存菌种。细菌生长情况的好坏会影响酶活性，导致二者出现相似的变化规律。故而较低的温度会抑制细菌的生长和酶活性，过高的温度则会对细菌的生长和酶活性造成负面影响。由实验结果可知CA菌的最佳生长温度为25℃。

3.2 不同初始pH值对CA菌生长和酶活性的影响

在细菌生长过程中，培养基体系pH值变化的主要原因是在CA菌培养的开始阶段，生长繁殖产生的CA酶，会加速CO2的水合反应，从而生成H+，使体系溶液中的pH值降低，而后随着培养时间的延长，细菌分解蛋白质会产生碱性的代谢产物，同时由于后期细菌自溶，核酸类物质外泄，从而导致培养液的pH值升高。在不同pH值溶液体系中，随着初始pH值的升高，细菌生长受到抑制和酶活性降低的主要因为是不同的pH值会影响微生物细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收，从而影响细菌新陈代谢的进行，在细菌生长受到影响的同时，细菌所分泌酶的效率降低，导致酶活性的降低。溶液中过高的初始pH值会影响细菌的生长繁殖，不利于细菌的新陈代谢，并严重影响所分泌的碳酸酐酶活性。

3.3 Ca2+浓度对CA菌生长和酶活性的影响

不同Ca2+浓度会影响细菌的生长繁殖情况和酶活性，尤其是随着外加Ca2+浓度的增加，细菌的生长受到严重抑制，对应的酶活性也较低。这主要是因为，高浓度的Ca2+会影响CA菌细胞膜周围的渗透压，水分将通过细胞膜从低浓度的细胞内进入到细胞周围的溶液中，造成细胞脱水而引起质壁分离，使CA菌不能生长甚至死亡。而低浓度的Ca2+能起到维持细胞周围渗透压的作用，为CA菌细胞的新陈代谢提供良好的外部环境，从而加速细菌的生长，并提高对应的酶活性。由以上分析可知，50 mmol/L的Ca2+浓度有利于CA菌的生长，并且此时的酶活性也最高。

3.4 矿化产物分析

图9是不同初始pH值下得到的CaCO3沉积物的XRD图谱，从图中可以看出，初始pH为7.5和8.5时，所得沉淀为方解石和球霰石复合晶型的CaCO3，初始pH值为9.5的培养液中所得的主要是方解石晶型的CaCO3，其中衍射角2θ = 29.40°9.40°得的主要是104）晶面，衍射角2θ =24.90°主要对应于球霰石的（110）晶面，而且除了方解石和球霰石的衍射峰，其他杂质衍射峰的强度可忽略，这表明产品纯度较高，而图中各衍射峰尖锐，则表明样品的结晶性良好。不同初始pH值下的CaCO3沉淀物的SEM照片如图10所示，从图中可以看出所得的矿化产物均是不规则形貌的球形，粒径大约为6 μm，其中，在初始培养液pH值为7.5时，所得CaCO3是由大量块状堆积而成，pH值为8.5的培养液所得CaCO3是由球状和方形状簇集而成，pH为9.5的培养液所得CaCO3则是由大量片状组成的。由此可知，pH值对于所得到的CaCO3的形貌和晶型具有很大的影响，具体表现在不同pH值下，菌的量和酶活性对所诱导的CaCO3的形貌和晶型有所差异。

3.5 溶液中碳酸酐酶矿化机理

若溶液中没有碳酸酐酶存在，CO2的水合反应仅仅是CO2溶于水生成H2CO3以及H2CO3在碱性条件下电离为CO32-的过程，此时CO2溶于水生成H2CO3非常缓慢，其转化系数仅为1.3 × 10-1s-1［12］，是整个反应的限速阶段。

图9 矿化产物的XRD图谱

图10 矿化产物的SEM图

而在微生物生长繁殖过程中产生的碳酸酐酶的催化作用下，CO2的水合机制发生了改变，CA能加速上述反应的进行，CO2的水合转化系数显著提高至1.0 × 106s-1［12，14］，是自然界的约107倍，大大提高了CO2的水合反应。

由以上微生物生长繁殖、酶活性及矿化产物的研究可知，整个微生物诱导CaCO3矿化反应过程分为以下4个阶段：微生物的生长繁殖阶段、矿化离子的形成阶段、成核位点的吸附阶段以及矿化产物的沉积阶段。其中微生物在生长繁殖过程中，会产生碳酸酐酶，这极大的促进了CO2的水合反应，加快了CO2在碱性溶液中的溶解，从而产生CO32-，为矿化产物的沉积提供了必需条件；在外加钙源存在的情况下，由于微生物细菌体自身带负电荷，会使带正电荷的Ca2+吸附在菌体表面，为矿化产物的沉积提供了成核位点，最终形成不同晶型的CaCO3。在整个矿化过程中，CA催化矿化离子的形成及矿化产物的沉积的具体过程如下［14，18-19，21］：

（1）碳酸酐酶活性中心的Zn2+作用于与之相连的水分子，将其去质子化形成E·ZnOH-：

（2）由于E·ZnOH-中氢键的存在，其中的氧原子具有很强的亲核性，能够与溶液中的水化CO2相结合，形成E·ZnHCO3

-：

（3）随后E·ZnHCO3-中的HCO3-被溶液中的H2O取代，形成E·ZnOH2和HCO3-：

（4）在碱性的溶液中，HCO3-与OH-反应，生成CO3

2-和H2O：

（5）由于微生物菌体自身带负电荷，会吸附Ca2+在其表面聚集：

（6）微生物菌体作为成核位点，促使矿化产物在其表面沉积：

由以上反应可得出微生物产生碳酸酐酶催化CO2的水合反应机理的过程示意图（图11），此水合机理的建立对探索CA菌的潜在应用具有一定的参考意义。

图11 碳酸酐酶催化CO2水合反应机理的过程示意图

4 结论

选用可产生碳酸酐酶的胶质芽孢杆菌进行培养，研究了温度、pH值和Ca2+浓度对CA菌生长和酶活性的影响，得出CA菌最佳的培养条件为25℃、pH值为8.5的培养基，Ca2+浓度为50 mmol/L，此时的细菌生长繁殖良好，并且酶活性也较高。同时研究了溶液中微生物产生碳酸酐酶诱导CaCO3沉积的矿化机理，微生物所产生的CA能够加速CO2的水合反应，在碱性条件中，生成CO32-，当有外加钙源时，能够与Ca2+反应进而生成CaCO3。