来源于Laceyella sp.的α-淀粉酶基因克隆、重组表达及酶学性质研究

赵海燕 宋晨斌，2 刘正亚 马兴荣 尚会会 李安华 关现军 王建设

（1. 安阳工学院生物与食品工程学院 安阳市微生物工程重点实验室，安阳 455000；2. 天水师范学院生物工程与技术学院，天水 741001）

淀粉是普遍存在于植物体内，用于植物贮存能量的一种多糖［1］。目前生产淀粉的原料主要是玉米、小麦、薯类、稻谷等作物［2-3］。我国作为农业大国，根据中国农业统计资料显示截止到2017年，上述四类作物的产量已占我国粮食总产量的90%以上［4］。淀粉是以葡萄糖为单位通过α-1，4糖苷键连接的高分子碳水化合物。依据单糖连接方式，淀粉可分为直链淀粉和支链淀粉［5］。淀粉是人类的重要食物来源，也是多种工业生产的原料［6］。淀粉加工工艺主要有酸法、酶酸法、全酶法和双酶法等。其中，酶法在国内外加工淀粉中已广泛应用［7］。α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）是指通过水解淀粉分子内部中的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为糊精、单糖、少量麦芽糖和葡萄糖的一类酶［8］。来源于细菌和真菌的α-淀粉酶被广泛应用于食品、生物燃料、造纸、医药、纺织、洗涤剂、动物饲料等行业，占整个酶制剂市场的25%-30%［9-10］。在面团发酵过程中，淀粉酶通过对淀粉的水解作用提高面团的糖含量，进而增大面包的体积，改善色泽［11-12］。在超声波作用下对织物进行酶退浆，不仅可以提高退浆效率，还缩短退浆时间［13］。在生物乙醇的生产过程中，淀粉酶发挥着将原料醪液液化的作用［14］。淀粉酶还可以将含淀粉的食物颗粒水解成小分子的水溶性寡糖，用水冲洗后可去除污渍。当前90%的液体除垢剂中含有α-淀粉酶［15］。将淀粉酶添加到动物饲料中，可有效提高饲料中淀粉的消化率，有利于动物的生长发育［16］。

在不同的应用领域，对淀粉酶性能的要求不同。特别是工业化生产中的高温、低温、高盐、碱性、酸性等苛刻条件制约着淀粉酶产业的发展［17-18］。因此，随着全球资源环境压力的持续增大和绿色合成产业的需求，酶的应用和需求量迅速增加，酶基因资源的挖掘和开发显得非常迫切。目前，热稳定性的α-淀粉酶主要来源于细菌（特别是芽孢杆菌），而放线菌和真菌来源的报道较少［19］。高温放线菌类群是一类能够在极端环境下生长代谢的革兰氏阳性、化能异养菌。微生物学界认为它是介于细菌和放线菌之间的一类微生物。高温放线菌具有代谢产物丰富，很多具有重要的工业价值，其中蛋白酶、淀粉酶、脂酶、纤维素酶等应用广泛［20］。2005年，Yoon等［21］报道高温放线菌-莱斯氏属（Laceyella）。其主要分布于大曲［22-23］、温泉［24］、海洋［25］、土壤［26］、堆肥［27］等。朱国东等［28］从云南腾冲热泉中筛选到一株嗜热放线菌Laceyellasp.RHA1，淀粉酶的最适温度为60℃。来源于Laceyella sacchari5-氨基乙酰丙酸合成酶LS-ALAS不仅具有良好的热稳定性，还有较高的酶活力［29］。研究还发现，高温放线菌Laceyella sacchari有一定的降解纤维素的能力［30］。Singh［31］研究了Laceyella sacchariB42的木聚糖酶活性，其研究表明，最适反应温度和pH分别为9.0和60℃。在60℃处理6 h后还保存90%的活性。Dolashki等［32］研究了Laceyella sacchari酪氨酸酶的性质。Laceyella sacchari嗜热蛋白酶在乳酸乳球菌表达系统中成功表达，且重组酶的热稳定性好，还在pH 6.0-11.0范围内具有较高的活性［33］。来源于Laceyella putida葡聚糖酶LpGluA的最适反应pH和最适反应温度分别为4.2和60℃［34］。Laceyella sacchari亮氨酸脱氢酶Ls-LeuDH也具有较好的热稳定性［25］。在50℃处理72 h时，Laceyella sacchariLP175菌株聚乙丙交酯降解酶的粗酶对PLLA的分解效率达到91%［26］。另外，其还具有高效的生淀粉降解能力，生物乙醇的产量高达90.9 g/L［35］。Laceyellasp. DS3 α-淀粉酶AmyLa最适反应温度和pH分别为55℃和7.0，其固定化酶的最适反应温度没有变化，但是提高了在pH4.0-7.0范围内的酶活性［36-37］。来源于Laceyella sacchariTSI-2的α-淀粉酶在70℃和pH7.0时表现出最高活性，能够高效去除棉布上的淀粉污渍，其固定化酶的稳定性增强［19，38］。四甲基吡嗪作为Laceyella sacchari产生的大量代谢物，还被认为是酱香白酒风味的主体成分之一［23］。因此，积极开展嗜热放线菌Laceyellasp.的相关研究十分重要。

本研究从安阳面粉厂附近土壤里分离筛选产α-淀粉酶的Laceyellasp.菌株，采用同源克隆技术获取α-淀粉酶基因。其次，在大肠杆菌表达系统中进行功能研究。最后，基于同源建模方法的蛋白质三维结构，分析差异氨基酸位点与酶学性质上的差异，为进一步的分子改良提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品、菌株及质粒 样品：采集自安阳市面粉厂附近的土壤。

菌株：E.coli Trans1-T1、E.coliBL21（DE3）购自北京全式金生物技术有限公司。

质粒：pET-22b（+）表达载体由本实验室保存。

1.1.2 培养基 固体淀粉筛选培养基（g/L）：可溶性淀粉5 g，牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g。

高氏一号培养基（g/L）：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂20 g。

1.1.3 主要仪器设备 PCR仪：伯乐生命医学产品有限公司；HVE-50高压蒸汽灭菌锅：日本HIRAYAMA公司；SPECOOD S600分光光度计：德国耶拿分析仪器有限公司；HNY-ⅢB摇床：天津欧诺仪器股份有限公司；CF16RN高速离心机：株式会社日立制作所；电泳仪：伯乐生命医学产品（上海）有限公司；ÄKTA蛋白纯化仪：通用电气医疗集团。

1.2 方法

1.2.1 产淀粉酶菌株的筛选及鉴定 取适量土样加入到50 mL无菌水中制成土壤悬液，37℃，180 r/min培养20 min，作为原液。取原液进行梯度稀释，分别取10-4、10-5、10-6的稀释菌悬液100 μL涂布于固体淀粉筛选培养基上，37℃培养12 h。在固体淀粉筛选培养基上滴加碘液，选取能产生无色透明圈的菌落，且透明圈直径与菌落直径之比较大者进行菌株鉴定。

依据细菌基因组提取试剂盒说明书进行提取DNA操作。以细菌通用鉴定引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，扩增菌株的16S rDNA序列。PCR扩增完成后，取适量产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，以TAE缓冲液作为电泳缓冲液，电压150 V，20 min。条带大小验证正确后，取PCR扩增产物送至公司测序。在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站上，选用BLASTn程序对菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库进行比对分析。最后，依据LPSN（http：//www.bacterio.net/）公布的Laceyellasp.属标准菌株，通过MEGA7.0软件［39］的邻位相连法［40］，构建系统发育树。

1.2.2 α-淀粉酶基因AmyL的克隆 以Laceyellasp.DS3（GenBank号：LN901326）基因组序列中的α-淀粉酶基因序列为依据，设计正向引物MF-8-1 F：5'-GAAGTGACCCAGCTACGAGATGAGC-3'以 及反向引物MF-8-1 R：5'-GACCCCAACTATATCAAGC CAGAATTCGG-3'，通过PCR扩增得到α-淀粉酶基因AmyL全长。

1.2.3 pET-22b-AmyL重组质粒的构建 以重叠延伸PCR［41］（Overlap-PCR）构建重组表达载体。根据α-淀粉酶基因AmyL以及质粒pET-22b（+）的序列设计引物Amy MF-8-1 F1：5'-GGATATCGGAATT AATTCGGATCCGAATTCGCTTTCTCCTGCGGATTGGC AAG-3'、Amy MF-8-1 R1：5'-GTGGTGGTGGTGGTGC TCGAGTTTGGTGAATATCTTTACTTCTTTGGGGC-3'、Amy MF-8-1 F2：5'-GCCCCAAAGAAGTAAAGATAT TCACCAAACTCGAGCACCACCACCACCAC-3'、Amy MF-8-1 R2：5'-CTTGCCAATCCGCAGGAGAAAGCG AATTCGGATCCGAATTAATTCCGATATCC-3'。其中Amy MF-8-1 F1与Amy MF-8-1 R2反 向 互 补，Amy MF-8-1 R1与Amy MF-8-1 F2反向互补。

通过上述引物对基因以及质粒进行PCR扩增，引入同源臂。再以质粒扩增产物为模板、基因扩增产物为大引物，两者按照质量比为1∶10构建反应体系进行PCR扩增，吸取部分PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。将经由PCR扩增后构建成功的重组表达载体命名为pET22b-AmyL，并转化至E.coli Trans1-T1，同时选取菌液PCR验证正确的单克隆进行测序验证。

1.2.4 重组α-淀粉酶AmyL的表达及纯化 将测序正确的重组表达载体转化到E.coliBL21（DE3）中表达，然后以1%的接菌量转接于200 mL LB液体培养基（氨苄霉素浓度：100 μg/mL）中，37℃、180 r/min培养2 h至OD600达到0.6-0.8之间，加入400 μL 0.5 mol/L IPTG，30℃、180 r/min诱导4 h。

通过ÄKTA蛋白纯化系统纯化胞内总蛋白溶液［42］：（1）将胞内总蛋白溶液经0.22 μm滤膜过滤；（2）用结合缓冲液平衡层析柱；（3）取经过滤膜过滤的样品上样；（4）用洗脱缓冲液进行线性洗脱；（5）收集洗脱峰进行酶活性的测定。对纯化后的蛋白质进行SDS-PAGE以及HPLC-MS/MS质谱分析鉴定。

1.2.5 重组α-淀粉酶AmyL活性测定及性质研究 采用二硝基水杨酸（DNS）法［43］进行α-淀粉酶的酶活力测定。将900 μL 1%淀粉酶底物在45℃预热5 min，加入100 μL稀释的酶液反应10 min后，用DNS溶液终止反应，沸水浴5 min。反应液冷却至室温后，测定540 nm的吸光值。淀粉酶的酶活单位定义为：在最适温度和最适pH下，每毫升反应体系每分钟分解淀粉生成1 μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位。

1.2.5.1 最适反应温度的测定 在pH6.0反应体系下，分别测定温度在25-60℃时的酶活力，反应时间为10 min。酶活力最高点即为酶的最适反应温度，同时计算不同温度下的相对酶活力。

1.2.5.2 最适反应pH的测定 在45℃反应条件下，以柠檬酸缓冲液和磷酸缓冲液配制，分别测定pH为4.8、5.2、5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0时的酶活力，反应时间为10 min。酶活力最高点即为酶的最适反应pH，同时计算其他pH下的相对酶活力。

1.2.5.3 温度稳定性的测定 取适当酶液，分别放置在40、45、50、60℃下水浴保温10、20、30、50 min，测定残余的酶活力，以未处理的酶液作对照，计算处理不同时间后残余的相对酶活力。

1.2.5.4 pH稳定性的测定 取适当酶液在温度为45℃下，分 别 在pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0下保温1 h后，以未处理的酶液作对照，测定不同pH下处理后残余的相对酶活力。

1.2.5.5 酶促反应动力学研究 以经过蛋白质纯化后的目的蛋白，对淀粉酶的动力学参数进行测定。配制不同浓度的淀粉底物，基于淀粉酶的最适反应温度、最适反应pH，测定酶的活力，同时测定蛋白浓度，计算出酶的比活力。比活力定义：每毫克酶蛋白所含的酶活力单位。以1/［S］为横坐标，1/比活为纵坐标，作Lineweaver-Burk双倒数图［44］。

1.2.5.6 金属离子及化学试剂对酶活力的影响 在酶学性质测定反应体系中加入终浓度分别为1、5和10 mmol/L的不同离子及化学试剂，测定酶活力，以不加化学试剂的反应体系作为对照。探究不同金属离子及化学试剂对淀粉酶活力的影响。

1.2.5.7 底物特异性研究 将可溶性淀粉、支链淀粉、马铃薯淀粉、普鲁兰多糖、α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精等底物分别溶解于0.1 mmol/L pH 6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，终浓度为 5 mg/mL。加入适当稀释倍数的重组淀粉酶AmyL，在45℃下反应10 min。以可溶性淀粉为底物时的酶活力为100%，分别计算其他底物的相对酶活力。

1.2.6 重组酶的同源建模 从PDB数据库中检索与AmyL序列相似且功能已知的α-淀粉酶，以来源于Anoxybacillus的α-淀粉酶（PDB ID号：5A2B；序列一致性：56%）为模板，利用 Discovery Studio 2018软件对淀粉酶AmyL进行三维结构的建模。然后使用相关模块对构建好的模型进行能量最小化和结构优化，并采用Ramanchandran Plot和Profile-3D评估模型。Deepview软件也应用于部分结构功能分析。

2 结果

2.1 产淀粉酶菌株的筛选及鉴定

土壤样品经稀释涂布后，在固体淀粉筛选培养基上，选取具有较大透明圈的菌落作为候选菌株。在多次分离、纯化的基础上，获得目的菌株，编号为MF-8-1。菌株MF-8-1在固体淀粉筛选培养基上的菌落特征为纯白色、干燥、多皱、边缘不规则，能产生明显的透明圈。

提取MF-8-1的基因组，利用引物27F和1492R扩增其16S rDNA序列后进行测序。经序列比对后发现其与Laceyellasp.属的16S rDNA序列（GenBank号：EU430566.1）的一致性最高，序列相似性为99%。依据高温放线菌科及Laceyellasp.属的不同种16S rDNA序列，构建系统发育树（图1）。结果表明MF-8-1与Laceyella sediminis（GenBank号：FJ422144）的进化距离最小。

2.2 α-淀粉酶基因AmyL的克隆及序列分析

以MF-8-1基因组DNA为模板，MF-8-1 F、MF-8-1 R为引物，在KOD-Plus-Neo高保真聚合酶的作用下，扩增出一条2.2 Kb左右的片段，与预期DNA片段大小符合。测序结果表明该基因全长为1467 bp，编码488个氨基酸和一个终止密码子，将该基因命名为AmyL。利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对AmyL编 码 蛋 白 进行信号肽预测。结果表明AmyL编码蛋白具有一个由35个氨基酸残基组成的信号肽，剪切位点介于Leu35和Ser36之间。

图1 菌株MF-8-1的16S rDNA系统发育树

2.3 重组α-淀粉酶AmyL的诱导表达及纯化

将构建的重组表达载体转化到BL21，通过PCR方法验证，获得重组表达菌株。经IPTG诱导后，重组菌的细胞破碎液具有很高的淀粉酶活性，而空白对照无法检测出淀粉酶活性。同时，对培养两种重组菌的上清液进行淀粉酶活性的检测后，结果显示上清液均无活性，表明淀粉酶基因AmyL在周质中表达。

图2 重组α-淀粉酶AmyL的SDS-PAGE分析

对重组菌的胞内总蛋白进行蛋白纯化，并对纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳检测。结果表明AmyL基因在E.coliBL21（DE3）中得到了较好的表达（图2），在55 kD附近出现了较为明显的条带，且与预期大小相符。经质谱鉴定，有32个肽段与理论上的肽段相匹配，其肽段覆盖率为73%，说明重组子表达的蛋白质为AmyL。

2.4 重组α-淀粉酶AmyL的酶学性质

2.4.1 重组α-淀粉酶AmyL的最适反应温度及温度稳定性 重组α-淀粉酶AmyL的最适反应温度为45℃，在40-50℃下可保持较高酶活力，在60℃下酶活力全部损失（图3）。在40-50℃下，酶的稳定性较好，保温50 min后酶活力仍能维持在80%左右。但在60℃下处理50 min后，酶活力全部损失（图4）。

图3 温度对重组α-淀粉酶AmyL酶活力的影响

图4 重组α-淀粉酶AmyL的温度稳定性

2.4.2 重组α-淀粉酶AmyL的最适反应pH及pH稳定性 重组α-淀粉酶AmyL的最适反应pH值为6.0，在pH 5.6-6.8下具有较高的酶活性，其相对酶活在80%以上。pH＜5.6后，酶活力急剧下降。在pH 4.8、8.0处，酶活力完全损失（图5）。在pH 6.0-10.0时，酶活力均无下降且有些许上升，说明该酶能耐受偏碱性环境（图6）。

图5 pH对重组α-淀粉酶AmyL酶活力的影响

图6 重组α-淀粉酶AmyL的pH稳定性

2.4.3 重组α-淀粉酶AmyL的动力学参数 以0.1、0.4、0.7、1.0、2.0、3.0和5.0 mg/mL浓 度 的可溶性淀粉作底物，测定酶的活力；做Lineweaver-Burk双倒数图（图7），数据分析后得出酶的比活、Km和Vmax分别为185.39 U/mg、0.95 mg/mL、343.12 μmol/（min·mg）。进一步计算得出，AmyL的Kcat为315.28 s-1，催化效率Kcat/Km为331.13 mL/（s·mg）。

图7 重组α-淀粉酶AmyL的Lineweaver-Burk双倒数图

2.4.4 金属离子及化学试剂对重组α-淀粉酶AmyL的影响 以未加化学试剂的反应体系作为对照，得到不同浓度的金属离子及化学试剂对重组酶活力的影响如表1所示。当体系中Na+、K+、Ca2+浓度达到10 mmol/L浓度时，对酶活力有一定的保护作用，而较低浓度下会使酶活力损失；Mn2+、Mg2+、EDTA对重组α-淀粉酶AmyL均存在抑制作用，但Mn2+的抑制作用比Mg2+、EDTA略强；SDS对重组α-淀粉酶AmyL具有强抑制作用，即使只有1 mmol/L，也能使酶活力全部丧失，说明重组α-淀粉酶AmyL对SDS敏感。

表1 金属离子及化学试剂对酶活力的影响

2.4.5 重组α-淀粉酶AmyL的底物特异性 重组α-淀粉酶AmyL不仅可以高效地催化可溶性淀粉的水解，对其他底物也表现出较高的水解活性。将重组α-淀粉酶AmyL对可溶性淀粉的酶活定义为100%时，AmyL对于支链淀粉和马铃薯淀粉的相对酶活力分别为180.3%和111.6%，对β-环糊精和普鲁兰多糖的相对酶活力分别为2.5%和0.8%，而以α-环糊精和γ-环糊精为底物时，未检测到活性。

2.5 α-淀粉酶AmyL同源建模及结构分析

AmyL与 来 源 于Laceyella sacchari的α-淀 粉酶（TCW41560）的序列一致性为99%，与晶体结构已知的Anoxybacillusα-淀粉酶5A2B的一致性为56%。以5A2B作为模板，对AmyL进行同源建模。从结构上可以看出（图8），AmyL由3个结构域组成，即结构域A、B、C。结构域A由8个α-螺旋和8个β-折叠交替组成的TIM桶构成；结构域B是TIM桶的第3个α-螺旋和β-折叠之间形成的不规则β-like结构；结构域C由位于蛋白质C端的8个反平行β-折叠以及一些无规则卷曲构成。通过分析发现，结构域A的β3、β4、β5和β7折叠C端附近存在GH13家族的4个CSR：CSR I（152DVVANH157）、CSR II（228DGLRVDTVKHVPKWFWREF246）、CSR III（256GEVFHG261）和CSR IV（317FIDNHD322）。

图8 AmyL的三维结构

3 讨论

淀粉酶广泛存在于动植物及微生物中，其中微生物来源的淀粉酶具有各种不同的性质，在淀粉酶的开发研究中具有相当重要的地位。国内外报道产淀粉酶的微生物［29-35］主要有：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［45］、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）［46］、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）［47］、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）［48］、多粘类芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）［49］、高温放线菌（Thermoactinomyces）［50］等。

本研究根据Laceyellasp.DS3基因组序列中的α-淀粉酶基因序列，采用同源克隆从Laceyellasp.中克隆出α-淀粉酶基因AmyL并在大肠杆菌中表达。其最适反应温度为45℃，最适反应pH值为6.0，高浓度的Na+、K+、Ca2+能提高该淀粉酶的稳定性。朱国东等［28］从云南腾冲热泉中筛选到一株嗜热放线菌Laceyellasp.RHA1，经过硫酸铵沉淀和分子筛层析，获得低分子量的淀粉酶（11.2 kD）。其最适温度为60℃，最适pH值为6.0，Ca2+能够提高野生酶的最适反应温度。Lomthong等［35］利用发酵条件优化方法，研究了Laceyella sacchariLP175的分解酶对木薯生淀粉的降解能力；且生物乙醇的产量高达90.9 g/L（理论产量的88%）。来源于温泉的Laceyella sacchariTSI-2α-淀粉酶的最适反应温度为70℃，在37-100℃都具有酶活性，100℃处理1 h还保留70%以上的活性。其最适反应pH值为7.0，在pH 4.0-9.0内有酶活性；在pH 4.0条件下处理3 h，还保留60%以上的相对酶活力；在pH9.0条件下处理6 h，还保留70%以上的相对酶活力；固定化酶提高了在有机溶剂中的稳定性；表面活性剂还可提高相对酶活力；能够高效去除棉布上的淀粉污渍［19，38］。嗜热微生物Thermomyces dupontiiL18的TdAmy A的最适反应温度和pH值分别为50℃和6.5［51］。

Laceyellasp.DS3的α-淀粉酶的野生酶的最适温度为50℃，在E.coli中表达的重组AmyLa最适温度为55℃，最适pH为7.0；游离酶在pH3-5时的相对酶活力小于20%，在pH 6-7时的相对酶活力在80%以上；而固定化酶在pH3-8时相对酶活力保持在80%以上［36-37］。本研究的AmyL与α-淀粉酶AmyLa以及来源于Thermoactinomyces的α-淀粉酶AmyTV1［52］的酶学性质存在较大差异（表2）。但通过氨基酸序列比对发现三者的序列一致性极高，只存在4个位点的差异，分别是261、342、361、420位氨基酸。

为了从分子层面探究其酶学性质产生差异的原因，通过Discovery Studio 2018软件构建了AmyL、AmyLa、AmyTV1的三维结构，发现三者的整体三维结构基本保持一致，其中261、361位点位于结构域A的α-螺旋上、342位点位于结构域A的loop结构上、420位点位于结构域C的反平行β-折叠上（图8）。以AmyL作为参照，利用Deepview软件分析AmyLa、AmyTV1在上述4个氨基酸位点的氢键数目变化。结果显示，当361位氨基酸由组氨酸（AmyL）变 为 酪 氨 酸（AmyLa、AmyTV1）时，Tyr361与Thr365之间会形成一个新的氢键，该位点的氢键由4个变为5个。在蛋白质内部形成一个氢键所获得平均能量约为0.6 kcal/mol［53］。Suvd等［54］通过比较来源于嗜中温微生物Bacillus licheniformis的α-淀粉酶（Bacillus licheniformisα-amylase，BLA）以及来源于嗜热微生物Bacillus stearothermophilus的α-淀粉酶（Bacillus stearothermophilusα-amylase，BSTA）的 结构发现，BSTA较BLA在三维结构上增加了9个氢键，使得BSTA获得了更好的热稳定性。因此，氢键数量是重组酶AmyL的最适反应温度低于AmyLa、AmyTV1的最适反应温度的因素之一。此外，α-淀粉酶AmyL具有典型的（α/β）8桶状结构（TIM桶），该结构是α-淀粉酶具有催化活性的关键因素［55］。α-淀粉酶AmyL的361位点位于TIM桶的第8个α-螺旋C端上，氢键数量的增加使其在折叠成螺旋结构时易产生较大的构象张力［56］，进而引起熵变的增加使得AmyL的最适温度较AmyLa、AmyTV1有所下降。因此，361位点对AmyL的最适反应温度及最适反应pH具有重要影响。

表2 α-淀粉酶AmyL、AmyLa、AmyTV1的最适反应温度及pH比较

4 结论

本研究从安阳面粉厂附近土壤中筛选到一株具有淀粉酶活性的菌株，经过分子生物学鉴定，确定为Laceyellasp.。将其α-淀粉酶基因克隆，并在E.coliBL21（DE3）中成功表达。α-淀粉酶基因AmyL全长1 467 bp，编码488个氨基酸和一个终止密码子，在Leu35和Ser36之间存在信号肽酶切割位点。重组酶AmyL的最适反应温度为45℃，最适反应pH值为6.0，在温度为40-50℃、pH值为6.0-10.0的范围内具有较稳定的酶活力，其Km和Vmax分别为0.95 mg/mL和343.12 μmol/（min·mg），高 浓 度 的Na+、K+、Ca2+对重组酶AmyL酶活力有保护作用。