背景荧光猝灭-免疫层析法定量检测唾液中的安非他明

郭 畅，周 浩，许 芳，李新霞，李久彤，，李建光*

(1.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.上海鑫谱生物科技有限公司，上海 201318)

安非他明(Amphetamine,AMP)即苯丙胺，又称苯基乙丙胺、α-甲基苯乙胺，分子式为C9H13N，游离态AMP为无色或淡黄色挥发性油状物，味酸苦且带有胺臭，常见制剂为其硫酸盐或磷酸盐[1]。AMP类药物最初用于治疗嗜睡症、帕金森氏综合征、早发性痴呆和器质性精神病等，但由于其对机体造成的不可逆损伤，如兴奋毒性、氧化应激和代谢紊乱等，而被列为毒品[2-3]。《2019年世界毒品报告》[4]显示，全世界大约有2 900万人正在使用AMP类药物，其中，欧洲约有290万人使用过AMP。2018年，欧洲废水分析结果显示，AMP的人均使用量是冰毒的2.6倍。

目前，检测AMP类药物主要采用气相色谱法(GC)[5]、高效液相色谱法(HPLC)[6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[7]、超高效液相色谱-串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)[8]、毛细管电泳法(CE)[9]、酶联免疫分析法(EIA)[10]和荧光偏振免疫分析法(FPIA)[11]。相较于检测时程长且消耗大量有机试剂的色谱法，免疫分析法因其高特异性、高灵敏度、快速等优点近年来在毒品滥用监测方面得到广泛研究。

作者采用胶体金标记技术[12-14]，将单克隆抗体AMP-mAb标记到胶体金上，制备金标探针；再将AMP完全抗原AMP-BSA和羊抗鼠抗体IgG 依次包被到膜面荧光硝酸纤维素(NC)膜的检测线和控制线上，与金标探针等组装制备试纸条；结合全自动干式荧光免疫分析仪创建背景荧光猝灭-免疫层析法，对唾液中AMP进行快速定量检测。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

HF 13502S20型硝酸纤维素膜，Millipore公司；SI31-40型聚氯乙烯(PVC)胶板，韩感中国；吸水纸，上海捷宁生物科技有限公司；Fusion 5型样品垫，Whatman公司；KB50型玻纤,上海良值科技公司。

AMP标准品，Cerilliant公司；AMP抗体和抗原试剂，杭州隆基生物科技公司；小分子封闭剂DB1130，Blockmaster公司；碳酸钾、柠檬酸钠、氯化钠、氯化钾、硫氰酸钾(KSCN)、磷酸氢二钾、尿素(NH2CONH2)、十水硫酸钠、氯化铵、二水氯化钙、碳酸氢钠、氯金酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水为去离子水。

Simp 4型全自动干式荧光免疫分析仪，上海鑫谱生物科技有限公司；VELOCITY 14R型台式高速冷冻离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司；BSM-220.4型电子天平，上海卓精电子科技有限公司；MS-H280-Pro型数显加热型磁力搅拌器、MX-F型振荡器，大龙兴创实验仪器有限公司；L6S型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；Tecnai G2S-TWIN型透射电子显微镜，美国FEI公司；C6型切条机、T-DOA型台式点膜喷金一体机，韩感中国。

1.2 人工唾液的配制

取NaCl 0.126 g、KCl 0.964 g、KSCN 0.189 g、KH2PO40.654 g、NH2CONH20.200 g、Na2SO4·10H2O 0.763 g、NH4Cl 0.178 g、CaCl2·2H2O 0.228 g、NaHCO30.630 g，加入去离子水并定容至1 000 mL，用盐酸调pH值至6.8，混匀，即得人工唾液。

1.3 AMP系列标准溶液的配制

将1 mg·mL-1AMP标准溶液用人工唾液稀释成浓度(ng·mL-1)分别为0、10、25、50、100、200、400的AMP系列标准溶液。

1.4 胶体金的制备与表征

采用柠檬酸钠还原法[15]制备胶体金。取198 mL纯化水，加入2 mL 1%HAuCl4溶液，混匀后置于磁力搅拌器上加热至沸腾；然后快速加入5 mL 1%柠檬酸钠水溶液，继续加热至溶液呈酒红色；持续煮沸20 min后搅拌冷却至室温，即得胶体金。

利用紫外可见分光光度计测定胶体金的紫外可见吸收光谱，利用透射电子显微镜观察胶体金粒径大小。

1.5 金标探针的制备

取1 mL胶体金溶液，加入5 μL 0.1 mol·L-1K2CO3溶液、5 μg 单克隆抗体AMP-mAb，混匀后加入10 μL 10%的小分子封闭剂DB1130，充分混匀后于4 ℃、12 000 r·min-1离心12 min，弃去上清液，沉淀用纯水定容至200 μL，即得金标探针，即金标AMP-mAb 溶液，4 ℃储存，备用。

1.6 试纸条的制备及结果判读

试纸条包括PVC胶板、样品垫、铺金垫、膜面荧光硝酸纤维素(NC)膜和吸水垫等5部分，其结构如图1所示。

图1 试纸条的结构

制备：将NC膜贴到PVC板中间，用台式点膜喷金一体机先将1 mg·mL-1的AMP完全抗原AMP-BSA和0.5 mg·mL-1的羊抗鼠抗体IgG先后包被在NC膜的检测线(T线)和控制线(C线)处；再将金标探针包被在玻纤材料上，置于37 ℃烘箱内干燥4 h后取出；将铺金垫、样品垫和吸水垫依次贴于NC 膜的两端，相互重叠1.0 mm；用切条机切割成3.4 mm宽，并与干燥剂一起放入铝箔袋中，密封，备用。

结果判读：取待测样品溶液60 μL，滴加至试纸条的样品垫上，此时样品溶液会因毛细作用沿试纸条向前移动。当样品溶液中没有目标毒品AMP时(图1b)，溶液流经铺金垫后会溶解事先固定好的金标探针，随后金标探针会和T线上的AMP-BSA结合而显现胶体金的紫红色；剩余的探针继续向前移动，被C 线的二抗捕获，C线也出现紫红色条带；当样品溶液中含有AMP时(图1a)，部分金标探针会因优先与样品溶液中的AMP结合而不停留在T线上，T线颜色将变浅或消失。无论样品中是否含有AMP，C线都应该出现紫红色，否则该试纸条结果判定为无效。

1.7 背景荧光猝灭-免疫层析法的构建

在制备了AMP层析试纸条后，结合全自动干式荧光免疫分析仪创建背景荧光猝灭-免疫层析法检测唾液中的AMP。按1.6方法操作，室温层析5 min后，将试纸条插入全自动干式荧光免疫分析仪，扫描结束后自行记录F0(背景荧光强度)和F1(T 线荧光强度)及F0/F1值(T 线的荧光猝灭信号)。

1.8 背景荧光猝灭-免疫层析法的条件优化

1.8.1 试纸条的AMP-BSA最佳包被浓度

在试纸条的T 线上分别包被0.75 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1和2.0 mg·mL-1的AMP-BSA，C线上包被0.5 mg·mL-1的羊抗鼠抗体IgG。按1.6方法操作，测定F0/F1值，筛选AMP-BSA的最佳包被浓度。

1.8.2 金标探针的K2CO3最佳加量

取1 mL胶体金溶液4份，分别加入4 μL、5 μL、6 μL、7 μL 0.1 mol·L-1K2CO3溶液，再向各管加入5 μg AMP-mAb，混匀后加入10 μL 10%的小分子封闭剂 DB1130，充分混匀后于4 ℃、12 000 r·min-1离心12 min，观察各管颜色。以胶体金全部沉于底部且无胶体金贴壁现象发生时的K2CO3加量为最佳。

1.8.3 金标探针的AMP-mAb最佳加量

取1 mL胶体金溶液3份，加入5 μL 0.1 mol·L-1K2CO3溶液，再分别加入3 μg、5 μg、7 μg的AMP-mAb，按1.6方法操作，测定F0/F1值，筛选AMP-mAb的最佳加量。

1.9 背景荧光猝灭-免疫层析法的性能评价

以人工唾液为建标基质，配制AMP系列标准溶液。按1.6方法操作，采用背景荧光猝灭-免疫层析法测定AMP系列标准溶液的F0/F1值。以AMP浓度(ng·mL-1)为横坐标、有效试纸条上F0/F1值为纵坐标绘制标准曲线，运用 Origin 8.6软件进行拟合，得到AMP的拟合方程及相关系数。

对背景荧光猝灭-免疫层析法进行方法学考察，如重复性、检出限、加标回收率及特异性等，并与UPLC-MS/MS法进行比对，分析两种方法的相关性和一致性。

2 结果与讨论

2.1 胶体金的表征

胶体金的紫外可见吸收光谱与TEM照片如图2所示。

从图2可知，胶体金的最大吸收峰位于520 nm处，吸光度为0.9(图2a)；胶体金颗粒呈规整的圆形，粒径在22 nm左右(图2b)。

图2 胶体金的紫外可见吸收光谱(a)与TEM照片(b)

2.2 背景荧光猝灭-免疫层析法的条件

2.2.1 试纸条的AMP-BSA最佳包被浓度

不同AMP-BSA包被浓度对应F0/F1值与AMP浓度的关系曲线如图3 所示。

图3 不同AMP-BSA包被浓度对应F0/F1值与AMP浓度的关系曲线

从图3可知，当AMP-BSA包被浓度为 0.75 mg·mL-1时，F0/F1值与AMP浓度的变化关系不明显；当AMP-BSA包被浓度为1.5 mg·mL-1时，阴性和10 ng·mL-1AMP的F0/F1值区别不大；当AMP-BSA包被浓度为1.0 mg·mL-1时，F0/F1值与AMP浓度的变化关系最明显，且低浓度AMP的F0/F1值差异较AMP-BSA包被浓度为2.0 mg·mL-1时更显著。因此，确定最佳AMP-BSA包被浓度为1.0 mg·mL-1。

2.2.2 金标探针的K2CO3最佳加量

实验发现，当K2CO3加量为4 μL时，离心后有部分胶体金贴壁，且弃去上清液后，贴壁胶体金不能完全复溶于纯水中；当K2CO3加量为5 μL、6 μL和7 μL时，离心后的胶体金全部均匀沉淀在试管底部，无贴壁现象，且上层溶液干净、透亮。因此，确定金标探针的K2CO3最佳加量为5 μL。

2.2.3 金标探针的AMP-mAb最佳加量

不同AMP-mAb加量对应F0/F1值与AMP浓度的关系曲线如图4 所示。

图4 不同AMP-mAb加量对应F0/F1值与AMP浓度的关系曲线

从图4可知，当AMP-mAb加量为5 μg时，不同浓度AMP的F0/F1值差异最显著，且每个浓度点的两次测量结果相对稳定。因此，AMP-mAb最佳加量为5 μg，即每标记1 mL胶体金溶液加入5 μg AMP-mAb。

2.3 背景荧光猝灭-免疫层析法的性能评价

2.3.1 标准曲线与检出限

AMP的标准曲线如图5所示。

图5 AMP的标准曲线

用Logistic模型(四参数)对标准曲线进行拟合，得到方程y=A2+(A1-A2)/[1+(x/x0)P]，R=0.9993，其中，A1=5.64403，A2=0.95357，x0=36.634，P=1.04805。表明，AMP浓度在0～400 ng·mL-1范围内与F0/F1值呈良好的相关性。

不同浓度AMP层析试纸条检测结果如图6所示。

1～7，AMP浓度(ng·mL-1)：0、10、25、50、100、200、400

2.3.2 重复性

按1.6方法操作，用背景荧光猝灭-免疫层析法测定10 ng·mL-1和 50 ng·mL-1AMP溶液各10次，F0/F1平均值分别为5.0129±0.0913、3.0485±0.1333，测得浓度分别为(7.28±0.89)ng·mL-1、(46.31±5.16)ng·mL-1，RSD 分别为12.23%、11.14%。表明，背景荧光猝灭-免疫层析法的重复性较好。

2.3.3 检出限

取空白试样，按1.6方法操作，用背景荧光猝灭-免疫层析法连续测定10次，F0/F1平均值为5.910 5，标准差(sd)为0.129 3，计算得到m-2sd，将其代入回归方程得到对应的浓度值，即为检出限0.9 ng·mL-1。

2.3.4 加标回收率

取500 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1的AMP溶液各100 μL，分别加入到1 mL浓度为25 ng·mL-1的AMP 溶液中，混匀后记为样品1和样品2；取500 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1的AMP溶液各100 μL，再分别加入到1 mL浓度为100 ng·mL-1的AMP溶液中，混匀后记为样品3和样品4。按1.6方法操作，用背景荧光猝灭-免疫层析法对4个样品溶液重复测定3次，计算加标回收率，结果见表1。

从表1可知，4 个样品溶液用背景荧光猝灭-免疫层析法测定的加标回收率在86.66%～99.50%之间，均在85%～115% 之间。表明，用背景荧光猝灭-免疫层析法测定的加标回收率较好。

表1 加标回收率测定结果(n=3)

2.3.5 特异性

分别取 5 mg·mL-1蔗糖，50 ng·mL-1的NaHCO3、薄荷醇和阿司匹林，非目标毒品1 000 ng·mL-1的可卡因、吗啡、美沙酮和氯胺酮，100 ng·mL-1的可替宁和芬太尼溶液，按1.6方法操作，重复测定3 次，检测背景荧光猝灭-免疫层析法的特异性。结果发现，10 种药品和非目标毒品对背景荧光猝灭-免疫层析法的检测无干扰。

2.3.6 比对实验

分别采用背景荧光猝灭-免疫层析法与UPLC-MS/MS法同时检测15例样本，运用SSPS 22.0软件对结果进行配对t检验。结果显示：t=0.969，P=0.349>0.05，表明背景荧光猝灭-免疫层析法与UPLC-MS/MS法无统计学差异。

以背景荧光猝灭-免疫层析法检测结果(x)为横坐标、UPLC-MS/MS 法检测结果(y)为纵坐标绘制关系曲线,如图7所示。

图7 两种方法检测AMP系列标准溶液的直线相关性

对图7进行拟合，得到一元直线回归方程y=0.91x+9.24，R=0.995>0.9，表明两种方法相关性良好。

2.4 讨论

近年来，免疫分析法在毒品滥用监测、食品检测[16]及疾病体外诊断[17]等方面得到广泛研究。张喜芳[18]研制的胶体金检测试剂能对尿液中的AMP进行定性检测。相比较而言，背景荧光猝灭-免疫层析法定量检测AMP灵敏度高、专属性强、检测范围较广，检测结果准确且重复性好，检测过程所需样本量少，所用试剂安全、无毒且环保，可在5 min内快速准确检测唾液中的AMP，打破了传统免疫层析试纸条只能对生物样本中的滥用药物进行定性检测的局限，有望成为法庭供述的依据。

3 结论

创建了背景荧光猝灭-免疫层析法定量检测唾液中的AMP。AMP浓度在0～400 ng·mL-1范围内与荧光猝灭信号呈良好的相关性，检出限为0.9 ng·mL-1，加标回收率为86.66%～99.50%，重复性RSD<13%，10 种常见毒品和药品均对检测结果无干扰，与UPLC-MS/MS法检测结果相关性良好。背景荧光猝灭-免疫层析法可以快速定量检测唾液中的 AMP，具有良好的相关性、精密度和准确性，操作简便，成本低且仪器便于携带，适于快速现场检测和基层推广。