HPLC法同时评价不同桑黄提取物中3种主要化合物的含量

张勇，左朋，周美琪，王晶，李福森，刘春明

（长春师范大学中心实验室，吉林长春130032）

桑黄是一种珍贵的真菌，在我国分布比较广泛，主要生长在桑树、杨树等阔叶树的树干上[1-2]。桑黄中含有多种化学成分，其中，多糖、黄酮、三萜和酚类物质为主要的活性成分。桑黄在抗癌、降血糖、机体免疫调节、消炎止痛、血管疾病等方面有良好的药理作用，近年来桑黄在抗癌及免疫调节方面受到了广泛的关注[3-5]。由于我国天然桑黄数量稀少，近年来开采较多，造成了桑黄野生资源的数量锐减。因此，人工培养桑黄蓬勃发展起来，但是人工培养桑黄的品质及化学成分与野生的相比有较大差异，桑黄有效成分含量差异也较大，故有必要对桑黄的质量进行合理的控制，通过试验找出适合桑黄培育的环境、培育优质人工桑黄的方法，为桑黄的研发提供基本保障[6-8]。目前，我国对桑黄的研究主要集中在对其化学成分和生物学特征以及药理方面的研究，但对桑黄中单体化学成分的含量分析的报道较少。

近十年来，高效液相色谱法广泛地应用于天然产物、医药和化工等科学领域，特别是在天然产物的分析和分离上应用广泛[9-10]。高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）具有高效、高灵敏度、速度快的特点，对桑黄进行检测分析，根据高效液相色谱图可以通过峰形、峰面积以及出峰时间直观地比较不同来源桑黄中活性成分的区别[11-12]，对比不同地区不同生长条件下的桑黄中单体化学成分的含量，为桑黄的质量控制提供一定的试验依据[13-14]。

davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 为桑黄中含量较高的3种化合物[15]，见图1。从结构上看，其属于典型的多酚类成分，经研究证实具有多种药效作用，该文选取了多种不同来源的桑黄，包括不同生长年份的野生桑黄以及人工栽培的桑黄，考察不同桑黄提取物中3种化合物的含量，为桑黄资源的开发利用提供理论基础。

图1 3种化合物的化学结构Fig.1 Chemical structure of the three compounds

1 材料与方法

1.1 材料

桑黄A：杭州千岛湖桑之宝农业开发有限公司；桑黄B：金寨县永福桑黄菌种植专业合作社；桑黄C：山东黄河林道千年古桑林菇园桑黄研究所；桑黄D和桑黄E：浙江桑之路桑黄有限公司；野生桑黄F（约3年）：山东省菇园食用菌科技有限公司；野生桑黄H（约10年）、野生桑黄K（5年以上）：吉林延边华厦有限公司；桑黄G（约3年）和桑黄I（约2年）：通化十月细润生物科技有限公司；桑黄J：安徽蓝溪生物科技有限公司，桑黄菌种资源为桑黄纤孔菌Inonotus sanghuang。

甲醇、醋酸（色谱纯试剂）：加拿大Caledon Laboratories Ltd.公司；davallialactone、hypholomine B、inoscavin A（纯度≥95%）：长春师范大学中心实验室自制；其它试剂（均分析纯）：北京精细化学品有限公司。

Thermo U3000高效液相色谱仪、配备DAD检测器：美国赛默有限公司；Hei-VAP型旋转蒸发仪：德国Heidolph公司；FA1204A电子分析天平：德国桑塔瑞斯公司；FW-100型高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；YoungLin Istrument超纯水制备器：韩国Younglin Istrument公司；KH-250DB型数控超声波清洗器：昆山禾创超声仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

精密称取桑黄粉末（A：1.000 0 g、B：1.000 2 g、C：1.000 3 g、D：1.000 5 g、E：1.000 3 g、F：1.000 2 g、G：1.000 8 g、H：1.000 5 g、I：1.000 6 g、J：1.000 9 g、K：1.000 2 g），25 mL部80%乙醇为溶剂进行超声辅助提取，时间为60 min，温度为45℃，抽滤，减压回收，去除残渣，色谱甲醇定容至10 mL的容量瓶中，得到桑黄粗提物，4℃冰箱保存，待用，HPLC检测前过0.45 μm 滤膜。

1.2.2 标准品溶液的配制

分别准确称取 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 0.500 2、0.500 5、0.500 8 mg，色谱甲醇制成浓度为500 μg/mL的贮备液，过0.45 μm的滤膜，制得对照品溶液。

1.2.3 液相色谱条件

HPLC的分析条件：流动相为乙腈（A）和0.2%醋酸水溶液（B）；色谱柱为 Thermo U3000 C18（250 mm×4.6 mm，5 mm）。柱温：25℃；检测波长：395 nm；流速：0.5 mL/min；进样量：5 μL。洗脱梯度如表1所示。在此条件下，对 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A标准溶液及不同桑黄提取物进行HPLC分析。

表1 HPLC洗脱梯度Table 1 HPLC elution gradient

2 结果与分析

2.1 标准曲线的线性关系与范围

将 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 溶液浓度稀释为 2.5、4、5、7.5、10 μg/mL，依次进入高效液相色谱中相同条件进行检测，得到色谱图。分别以质量浓度（x，μg/mL）为横坐标，峰面积（y，mAU）为纵坐标制作 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 标准曲线见图2。

图2 3种化合物的标准曲线Fig.2 Standard curves of the three compounds

3种化合物的线性回归方程分别为：y=8.856 7x+0.171 4、y=100.63x+75.786、y=7.493 8x-13.284，相关系数分别为 r=0.998 9、0.998 1、0.999 9，结果表明，在 2.5 μg/mL～10 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验

按照“1.2.2”对照品溶液和“1.2.3”的色谱条件，重复进样5次，测定色谱峰面积，以峰面积考察精密度，davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 峰面积的相对标准偏差（relative standrd deviation，RSD）分别为0.49%、0.57%、0.75%（n=5），表明仪器精密度良好。

2.2.2 稳定性试验

选取桑黄H同一样品溶液，分别于制备后的0、2、8、12、18、24 h，按“1.2.3”色谱条件进行 HPLC 测定，桑黄样品中 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 的相对峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为 0.67%、0.66%、0.73%，表明样品在24 h以内稳定。

2.2.3 重复性试验

取同一批桑黄H药材各5份，以乙醇为溶剂，超声提取物法制备样品溶液，分别应用于HPLC进行测定。结果表明，桑黄中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A的平均含量分别为2.95%、1.21%、1.39%，峰面积含量的RSD分别为0.62%、0.58%、0.41%，表明该方法的重复性较好。

2.3 不同桑黄提取物中3种化合物的含量评价

为了高效率地对样品中有效成分进行提取，以乙醇为溶剂，采用超声提取法对桑黄中目标成分进行提取，将处理好的桑黄样品按照1.2.3中液相色谱条件进行分析。在测试过程中，分别考察以甲醇和乙腈作为有机流动相，甲醇作为洗脱溶剂时色谱系统压力较乙腈大，并且峰形较宽，洗脱时间也会相对较长，因此，选用乙腈作为洗脱的流动相。通过试验表明向水相中加入一定量的醋酸，能有效防止分子在水相和有机相中电离，有利于改善样品的色谱峰形状和基线，避免出现拖尾和基线漂移[16-17]。因此，选用了乙腈-0.2%醋酸水溶液作为流动相对桑黄样品进行梯度洗脱。

HPLC检测11种不同的桑黄提取物的结果见图3。

如图3所示，在选定的条件下，桑黄中各主要成分得到较好的分离，目标成分davallialactone、hypholomine B、inoscavin A和其他化合物的色谱峰在谱图中基本得到基线分离，该方法可以用于桑黄中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 的定量分析[18]。

图3 11种不同来源桑黄提取物的液相色谱图Fig.3 HPLC of 11 extracts from different sources of Phellinus igniarius

根据图3所示，3种化合物色谱峰保留时间与桑黄提取物样品中化合物色谱峰保留时间基本一致，不同桑黄提取物中大部分峰为共有峰，这说明提取物中含有的组分较为相似，而不同提取物中色谱峰高、峰面积有所区别，则说明在不同桑黄提取物中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 的含量有一定差异。其中，C、D、I桑黄样品中目标化合物色谱峰较其它样品差异较大，样品中davallialactone峰较高，而之后基本未出峰，说明该样品中未检测到hypholomine B和inoscavin A。

2.4 11种不同来源桑黄中3种化合物的含量比较

应用HPLC法对11种桑黄提取物中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 的含量进行检测，结果见表2。

根据表2数据表明，在11种桑黄样品中，野生桑黄提取物中 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量高于人工栽培桑黄。其中C、D、J桑黄样品（均为人工栽培）中未检测到hypholomine B、inoscavin A，I桑黄样品中未检测到hypholomine B。桑黄H和F样品中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 含量最高，基本上达到了1%以上，桑黄A、桑黄K、桑黄E和桑黄 B 样品中 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量次之，达到了0.2%～0.6%之间，而桑黄C、桑黄D、桑黄I、桑黄G和桑黄L样品中davallialactone、inoscavin A含量相对较少，在0.1%～0.2%之间，未检测到hypholomine B。

表2 11种不同产地davallialactone、hypholomine B、inoscavin A的含量Table 2 Contents of davallialactone，hypholomine B and inoscavin A in Phellinus igniarius of 11 species from different habitats

对比人工栽培桑黄C、桑黄D和桑黄I，未检出hypholomine B、inoscavin A，差异的结果可能与栽培过程中的培养条件及培养基组成有关；而桑黄A、桑黄B桑黄E、桑黄G和桑黄J中，3种单体化合物的含量相差很大，可能是与人工栽培生长年份、生长环境等不同因素有关。

对比野生桑黄，桑黄K（约5年以上）、桑黄H（约10年） 和桑黄 F（约 3年） 中 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量，桑黄H中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量最高，而桑黄K中3种单体化合物的含量较低，初步判断可能是与生长年份有关，生长时间长有利于3种单体化合物的累积，也可能与子实体生长的树种有关。

3 结论

近年来，桑黄因其广泛而优异的药理活性，受到广泛关注。由于大量的采摘，致使我国野生桑黄数量稀少，因此培育优质桑黄快速发展，但人工栽培桑黄与野生桑黄中有效成分含量差距较大。本研究应用HPLC法评价不同桑黄提取物中的davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量，该方法简便，结果准确，精密度、稳定性、灵敏度高和重复性良好。通过对比这11种不同来源的桑黄样品中3种含量较高的有效成分含量发现，桑黄中 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量与桑黄生长环境、生长年份以及培育方式有关，该研究为桑黄的质量控制及相关药物研发提供一定试验依据。