桑黄质量标准研究进展及制定建议

长 城，郑海婷，于文杰，秦立武 ，牛丽君 ，范宇光

(1.长白山科学研究院，吉林 二道白河 133613；2.长白山生物群落与生物多样性吉林省联合重点实验室，吉林 二道白河 133613；3.长白山保护开发区水资源管理服务中心，吉林 二道白河 133613；4.海南医学院药学院，海南 海口 571199；5.海南省药用植物研究开发重点实验室，海南 海口 571199)

桑黄是一类重要的药用真菌，在我国历代本草著作中均有记载，最早可见于《神农本草经》.桑黄具有治疗痢疾、盗汗、血崩、脱肛泻血、带下、闭经、止泻、延年等功效[1]，以及抗肿瘤、保肝、降血糖、增强免疫力、抗氧化、抗菌、抗炎、抗诱变、抗突变等作用，主要用于预防或治疗癌症、糖尿病、关节炎，以及胃肠道功能紊乱、腹泻和过敏等，在东亚地区尤其是中国、日本和韩国有广泛应用[2].

近年来，因具有良好的药理活性，国内关于桑黄的研究成果、科研项目逐年增加.吉林、浙江、陕西等地均有桑黄生态栽培[3-4]，桑黄茶、桑黄护肤品、口服液等桑黄终端产品已经上市，但桑黄质量评价、质量控制标准滞后，未列入国家药典、部颁标准等国家级标准，严重影响了桑黄作为医药、保健品等市场新兴产品的销售与监管.本文将简要梳理桑黄分类、栽培、发酵情况，参考2020版《中华人民共和国药典》[5](下文简称《药典》)综述桑黄质量评价研究进展，针对桑黄标准化质量控制无国家级标准的问题，提出未来制定桑黄标准的建议，以促进桑黄产业健康发展.

1 桑黄基源、人工栽培及发酵

1.1 桑黄基源

虽然在我国历代本草著作中多有记载，但桑黄的基源物种一直未能明确.桑黄曾经被认为隶属广义木层孔菌属(Phellinuss.l.)或纤孔菌属(Inonotus)，在2012年之前的文献中多以火木层孔菌(Phellinusigniarius)、裂蹄木层孔菌(Phellinuslinteus)被记载和报道.直到2016年，周丽伟等[6]建立了桑黄孔菌属(Sanghuangporus)，该属包含民间被当作“桑黄”应用的核心种类，如桑树桑黄(S.sanghuang)、杨树桑黄(S.vaninii)、小孔忍冬桑黄(S.lonicericola)和暴马桑黄(S.baumii)等.2019年又发现该属一新物种——漆树桑黄(S.toxicodendri)[7]，该种在神农架林区也被当作桑黄使用.目前，全球已知桑黄孔菌属14种，中国分布有8种(见表1)[8-9].另外，在考证大量本草文献的基础上，也有观点认为新疆、山东等地生长于桑树上的粗毛纤孔菌(Inonotushispidus)是传统中药桑黄的基源物种[10].目前，关于桑黄性状的描述多集中在药材检验的“眼看”，未见关于“手摸”“水试”等常规药材检验方法.同时，桑黄类真菌在分类学上主要属于桑黄属、纤孔菌属，关于桑黄基源物种尚存在一定争议，且民间应用的桑黄种类更为宽泛，因此，有必要结合药理活性、有效成分含量、安全性评价等手段明确桑黄来源.

表1 中国桑黄孔菌属种类Tab.1 Species of Sanghuangporus in China

1.2 桑黄人工栽培

根据国家药品监督管理局2018年发布的第16号通告——《省级中药饮片炮制规范修订的技术指导原则》[11]，应对饮片的药材原植物产地和资源情况进行全面调查研究.随着野生桑黄资源的急剧减少，桑黄的规范化栽培成为桑黄作为中药材应用的必经之路.目前，国外仅见韩国和日本有关于桑黄人工栽培的报道，我国学者正积极开展桑黄人工栽培技术研究[12-15].不同地域逐渐形成了差异化的栽培模式，比较有代表性的是短木段栽培模式和袋料栽培模式.短木段栽培模式主要在吉林省长白山区，安徽省大别山区的金寨县也有一定规模；袋料栽培模式主要在江浙地区，正逐渐向工厂化方向发展.于文杰等[16]、范宇光等[17]充分利用长白山区的气候优势，采用本地杨树桑黄菌株进行桑黄生态栽培技术探索，最终形成了从菌种选择、菌段生产、接种到子实体自然培育、采收的关键技术，实现了杨树桑黄的原生境生态栽培.近年来，粗毛纤孔菌也被成功驯化[18]，其袋料栽培在山东、山西及河南等地发展迅速.林蔚红等[19]研究了桑黄主要病虫害种类，调查了桑黄设施化栽培环境监测与病虫害发生情况，总结出桑黄病虫鼠害的防控措施.综上可知，桑黄的栽培技术已日渐完善，并在不断发展，不同地区逐渐形成了适合本地的栽培模式.然而，即使同一地区从事桑黄栽培的企业或组织之间在技术细节上仍存在不少差异，这些差异足以影响到桑黄子实体的产量和品质.

1.3 桑黄发酵

桑黄发酵是扩大桑黄产业产能、保护野生桑黄资源的有效手段.桑黄发酵过程具有低能耗、高效率和低污染等特点，发酵产品可作为生物制剂加以应用.宋红志等[20]以桑黄菌株为对象，以菌丝体生物量为考核指标，开展了桑黄菌丝体液体摇瓶发酵培养条件单因素试验，筛选出比较适合的培养条件；TIAN Xuemei等[21]以菌丝体中的黄酮、总酚、多糖为指标，优化了桑黄发酵过程；周蔓等[22]通过观察、对比接种于不同氮源、碳源培养基中的桑黄菌丝体生长曲线、生长形态、生物量、生理生化等指标，筛选出最适合桑黄菌丝体生长的培养基；高丽霞[23]将抗菌肽基因导入抗病新型桑树苗，发酵新型桑树苗培养基，提取桑黄发酵菌粉，对比研究了新型桑黄发酵菌粉与原始桑树桑黄子，结果发现，新型桑黄发酵菌粉中，氨基酸总和及Ca、Na、Fe、Zn、Mg的含量都高于原始桑树桑黄子实体，说明桑树桑黄发酵菌粉的新型培养方法可行，发酵菌在弱酸性环境中的产量更高.

2 桑黄质量标准与质量控制

2.1 分类学鉴别

吴声华等[9]、戴玉成等[1]对我国桑黄的中文名(俗名)、拉丁名及主要性状、显微特征进行了研究和总结；周蔓[24]鉴定了桑树桑黄，包括生物学特性、子实体形态宏观观察，显微镜、扫描镜微观观察，开展了基于ITS序列的分子鉴定；王伟科[25]采用rDNA-ITS 序列分析技术，参考《药典》中有关中药材及中成药部分检验项目，对收集到的国内22个桑黄菌株进行分子鉴定，分析遗传多样性，结果发现，大多采用形态与显微观察方法，较少采用分子生物学手段进行鉴别、判定.目前，《药典》(一部)中蛇类动物药、川贝母植物药等都采用聚合酶链式反应方法检测，而被当作“桑黄”应用的真菌种类多，区分难度大，仅依靠肉眼与显微技术不足以完全准确区分，也可以采用这种方法加以鉴别.

2.2 化学鉴别

徐宾朋[26]采用薄层色谱法鉴别桑黄中的亮氨酸.参考《药典》中菌物药灵芝的标准，以活性成分——灵芝多糖作为含量检测项目，以半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖为对照品进行薄层鉴别.《安徽省中药饮片炮制规范(2019年版)》[27]中对桑黄进行了原儿茶醛和亮氨酸薄层鉴别，结果发现，桑黄多糖成分为其重要的活性物质[28]，根据多糖理化性质[29]可以对其中的葡萄糖、甘露糖、半乳糖进行薄层鉴别.由于桑黄来源广泛，在进行薄层鉴别时，应有桑黄对照药材参与试验.

2.3 水分、灰分、浸出物限定

《药典》中，水分、灰分是中药质量控制的一项重要指标，如果水分、灰分超标，不仅会影响中药饮片质量和中药制剂稳定性，也会影响性状、浸出物、含量等检验结果.陕西省地方标准(2018)[30]中桑黄的水分限定不高于13%，灰分不高于3.50%；《安徽省中药饮片炮制规范(2019年版)》[27]规定桑黄的水分不得超过16.0%，总灰分不得超过4.0%，酸不溶性灰分不得超过2.5%.对照《药典》，部分药材因指标性成分不清或含量很低，尚无精确测量的定量方法，需要测定浸出物含量.目前，除邓改改等[31]在忍冬木层孔菌质量标准研究中对忍冬桑黄的浸出物进行过测定外，尚未见关于其他桑黄浸出物含量测定的研究.

2.4 农药残留、重金属及有害元素限定

周蔓[24]对不同野生桑黄子实体中的Pb、Cu进行了测定，结果见表2；《药典》中关于植物类以及冬虫夏草的重金属及有害元素限量：ω(Pb)不超过5 mg/kg、ω(Cd)不超过1 mg/kg、ω(As)不超过2 mg/kg、ω(Hg)不超过0.2 mg/kg、ω(Cu)不超过20 mg/kg.由表2可知，桑黄样品安全性较好，可为桑黄质量标准制定提供参考.陕西省地方标准[30]对桑黄干品的农药残留、重金属及有害元素限定见表3.暂未发现桑黄中蓄积某种生物毒素.无论野生品种桑黄还是栽培品种桑黄生长周期均较长，应对其农药残留及重金属进行监测，以保证用药安全.

表2 桑黄子实体中Pb、Cu含量[24]Tab.2 Contents of Pb and Cu in the fruiting body of Sanghuang mushrooms /(mg·kg-1)

表3 桑黄干品的农药残留、重金属及有害元素限定[30]Tab.3 Limits of pesticide residues，heavy metals and harmful elements in dried Sanghuang mushroom ω/(mg·kg-1)

2.5 活性成分含量测定方法

目前，桑黄活性成分含量测定多集中在多糖、总黄酮、三萜、多酚[30-33].寿旦[34]采用高速逆流色谱法从桑黄提取液中制备出名为inoscavin A和Hypholomine B的2个单体成分，建立了含量测定方法，并成功应用于桑黄样品检测；邓改改等[31]选择麦角甾醇过氧化物和3，4-二羟基苄叉丙酮作为忍冬木层孔菌质量标准的特征性成分进行含量测定；《安徽省中药饮片炮制规范(2019年版)》[27]以麦角甾醇含量为指标，采用高效液相色谱法进行含量测定；李庆杰[35]从寄生于蒙古黄榆的粗毛纤孔菌中自制phelligridin D为对照品，建立了phelligridin D含量测定方法，同时建立了指纹图谱，结果表明，指纹图谱法稳定可行，可有效鉴别粗毛纤孔菌.目前，尚没有一种公认的桑黄活性成分可对其进行质量评价，因此，应更多地结合药理作用研究加以确认，并判断是否具有专属性.在桑黄单一活性成分评价得到学界认可前，可对不同品种桑黄进行特征指纹图谱研究，结合多指标成分定量分析，增加桑黄作为中药的质量整体可控性与可行性.

2.6 桑黄炮制

中药炮制的作用主要是增效减毒，古籍文献记载和现代研究证明桑黄无毒副作用.张赫男等[36]利用小鼠急性毒性试验和遗传毒性试验考察了桑树桑黄子实体粉的毒性，结果表明，桑树桑黄子实体粉基本无毒性.《安徽省中药饮片炮制规范(2019年版)》[26]中桑黄的炮制方法：取原药材，除去杂质，洗净，润软，切厚片，干燥，筛去碎屑；桑黄味甘、辛、微苦，寒，考虑可蜜炙或炒制，以缓和苦寒药性，同时补益脾胃.除此，暂未发现关于桑黄炒制、炙制等其他炮制工艺的研究与标准.

3 桑黄质量标准制定建议

目前，有关桑黄的质量标准并不多.颁布桑黄子实体质量标准的省份有安徽[27]、陕西[30]、甘肃[37]，有的桑黄栽培、销售企业参照国家农业部行业标准NY/1676—2008[38]对桑黄进行质量控制，浙江、吉林等桑黄产业大省正在加快制定桑黄中药材标准.随着桑黄产业的发展，应尽快建立国家级的桑黄质量标准.不仅要建立企业控制标准，也需要建立行业标准，通过建立各级标准，统一进行桑黄质量控制，为桑黄国家级质量控制标准制定做准备.

只有开展标准化、规范化栽培，才能更加准确地对桑黄进行标准化的质量控制.江苏、黑龙江、陕西、吉林等省份相继颁布了桑黄栽培技术规范标准[39-42](见表4)，为桑黄的标准化栽培奠定了基础.根据中药材标准“习用”的要求，可考虑将广泛栽培的杨树桑黄作为桑黄质量标准中的桑黄来源之一，以保证药材的道地性以及资源利用的可持续性.

表4 桑黄栽培技术规范Tab.4 Standard formulation and implementation of Sanghuang mushroom

3.1 科学选择桑黄基源

2019年10月29日，中国菌物学会桑黄产业分会在2019年工作会议上提出了桑黄属拉丁名统一用Sanghuangporus，并通过学会及《菌物学报》发布[43].虽然主流观点认为桑黄基源物种为桑黄孔菌属种类，但桦树桑黄(Phellinusigniarius(L.)Quél)、松木层孔菌(Phellinuspini(Brot.)Pilát)、落叶松木层孔菌(Phellinuslaricis(Jacz.ex Pilát))、亚马木层孔菌(Phellinusyamanoi(Imazeki)parmasto)、哈尔蒂木层孔菌(Phellinushartigii(Allesch.& Schnabl ) Bo ndart sev)等种类在民间也当作桑黄使用[4]，有必要进行相应的药理、药效及安全性研究，进而明确这些种类的利用前景.

作为药品，桑黄加入国家药典或部颁标准、行业标准需解决品种混乱的问题，建议遵循两条原则筛选法定品种：1)明确样品生物学来源.在进行药理活性研究、质量评价与控制、生态栽培、功能产品研制时都应确定生物学分类，结合性状描述、显微鉴别、分子生物学手段开展研究，如将DNA条码列入桑黄标准，既可拓展现代生物学技术在中药标准方面的应用，也有利于严格控制桑黄质量.2)明确活性成分及药理作用.应推进功能性成分研究，建立相关检测方法，结合古籍与现代研究成果、药用疗效，根据活性成分和药理研究数据筛选桑黄入药种类.

3.2 严格考量桑黄发酵产品

桑黄发酵产品可作为中药材或生物、化学制品应用，发酵过程具有时间短、见效快等优点，但其中的活性物质与传统应用的桑黄子实体是否一致，有待论证.同时，发酵过程容易发生染菌等污染，应严格对发酵产品进行相关微生物和毒素类考察与限定.

3.3 充分考虑桑黄道地性

桑黄野生资源急剧减少，生态栽培是桑黄产业发展的重要基础.只有规范生产栽培技术，才便于建立行之有效的质量控制标准.目前，桑黄来源不一，因地理气候等原因，南北栽培技术也不同，可根据各地模式化栽培情况进行区域化统一，执行行业标准，如可参考《药典》中南五味子、北五味子进行桑黄“南北”区分.

3.4 注重前瞻性、实用性和代表性

作为单一方剂，桑黄可视为药材进行质量控制，同时也可作为方剂中的一味药材进行质量控制，如《圣惠》卷中的白矾丸、《六十圣济总录》卷的补益桑黄丸，均是将桑黄作为方剂中的一味药材.但目前暂未发现市场中有此两味丸剂的中成药，相信随着桑黄应用的不断深入，含有桑黄的中成药可能会陆续出现在我国医药市场.因此，有关桑黄质量标准的研究应具有前沿性、实用性和代表性，只有这样，才能更加科学地对桑黄及其中成药进行质量控制.