短波紫外线对芒果黑曲霉、烟曲霉体外抑菌作用

麦馨允，黄江奇，杨建波，张开平，蓝常瑜，黄施方

（1.百色学院农业与食品工程学院，广西 百色 533000；2.龙邦海关，广西 靖西 533800）

芒果（Mangifera indica L.）属漆树科[1]，为呼吸跃变型水果。芒果采收期在亚热带高温多雨季节，同时芒果中含有大量糖分，容易引起真菌病害，导致芒果在采后贮运过程中腐烂，从而引起较大的经济损失。大量研究表明，芒果在生长和采后都容易被霉菌侵染，黑曲霉、烟曲霉是引起芒果病害的主要霉菌。Bhat[2]从芒果和番石榴中分离得到3种腐败真菌，分别为芒果拟盘多毛孢、烟曲霉、根霉；杨波[3]在对海南不同芒果产区采后真菌病害及潜伏侵染真菌调查研究中分离出黑曲霉，为芒果曲霉病的主要病原菌；郭建伟等[4]从贮藏、运输阶段的云南省河口县吕宋芒、三年芒及蒙自县三年芒的果腐病组织分离鉴定出黑曲霉，能引起三年芒采后果腐病，黑点状病斑布满整个果实，降低了芒果商品价值；Ainab等[5]在6个芒果种植区对芒果真菌叶斑病病株叶片进行病原菌的分离、鉴定，鉴定出长链格孢菌、烟曲霉、黑曲霉、灰炭疽菌等。黑曲霉、烟曲霉被认为是主要的芒果腐败真菌，Jaiswal等[6]在研究印度9个主要芒果品种果胶降解菌的多样性过程中，从芒果果实表面分离到11个属18个种共71个霉菌，其中黑曲霉最为常见，其次是烟曲霉，这两种霉菌都表现出果胶溶解活性。由此可见，腐败菌可以分泌大量的细胞壁降解酶来破坏和利用植物细胞壁作为营养源，从而缩短采后芒果的寿命，最终导致其质量下降、软腐变质和不可食用[7]。因此，如何灭活采后芒果黑曲霉和烟曲霉，对芒果采后保鲜具有重要意义。

短波紫外线照射（ultraviolet c radiation，UV-C），波长在100 nm～280 nm范围内，其具有灭活微生物的能力得益于两点：一是UV-C可破坏微生物DNA，使得遗传物质活性丧失，从而无法繁殖或直接死亡；二是UV-C辐照可提高芒果的抗病性，增强其抗氧化酶活性，从而抑制病原菌的感染。与具有灭活微生物作用的高频射线相比，UV-C的灭菌操作更加简便，安全性更高，在果蔬采后病原菌防治领域的应用更加广泛[8-10]。

本文以百色地区芒果检出率较高的黑曲霉、烟曲霉为目标菌，通过体外抑菌试验，分析UV-C照射时间与2种霉菌存活率的关系，并应用Bigelow模型、Modified Gompertz模型、Log-Logistic模型和Weibull模型对两种霉菌的失活曲线进行动力学分析，并通过计算模型参数、模型统计指标分别比较模型的拟合优度，以期得到该条件下描述芒果采后黑曲霉、烟曲霉灭活动力学的最优模型，为芒果采后黑曲霉、烟曲霉UV-C杀菌技术的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

黑曲霉（Aspergillus niger）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus），是从百色地区“五号”芒果和“金煌芒达康3号”芒果表面分离得到的检出率较高的霉菌。

1.2 材料与仪器

GNP系列恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；JBQ-ZD全温振荡器：金坛市晶玻实验仪器厂；SW-CJ-VS2超净工作台：无锡易纯净化设备有限公司；UVC254紫外线强度检测仪：东莞市聚德伟业电子有限公司；XSM系列生物显微镜：宁波舜宇仪器有限公司；FA1204B电子天平：上海精密科学仪器有限公司；YXQ-LS-50SLL压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司；试验过程中使用的玻璃器皿、接种工具、培养基等均在121℃下灭菌20 min备用。

1.3 方法

1.3.1 生长曲线测定

参照袁丽红[11]的方法，略作修改。挑取斜面保藏的菌种用平板划线法接种到PDA平板培养基中，并置于培养箱中28℃恒温培养5 d，重复划线接种2～3次，从而得到生长状况良好的霉菌菌落。将少量灭菌生理盐水加入到PDA平板中，用接种环轻刮培养物表面使孢子分散于灭菌生理盐水中，再将含有孢子的灭菌生理盐水转移至三角瓶中，用血球计数板测定出孢子悬浮液浓度，再根据适当的比例稀释，得到浓度为106个/mL的孢子悬浮液。吸取1.0 mL孢子悬浮液加入到30 mL的PDA液体培养基中，置于28℃，180 r/min的全温振荡器上振荡培养，每隔3 h～4 h取培养物测定菌丝体干重。测定时先将培养物抽滤于已烘干至恒重的坩埚（抽滤前称量m1）中，然后在100℃～105℃下烘干至恒重冷却后称量（m2），即求出菌体生物量（m2-m1）。

1.3.2 样品的处理

按1.3.1制备浓度为106个/mL的孢子悬浮液，将其接种并培养到对数生长后期，使其菌体浓度在107CFU/mL～108CFU/mL之间，再吸取1 mL菌悬液加入到9 mL的无菌生理盐水中，采用20 W紫外灯进行照射处理，利用UVC254手持式紫外线强度计测定放置样品处的辐照强度为1.40 W/m2，剂量分别为0、2.52、5.04、7.48、9.98、15.04 kJ/m2，对应的照射时间分别为 0、30、60、89、119、179 min。每个处理设 3 个重复。UV-C照射后，采用平板计数法对霉菌进行计数[12]。

1.3.3 霉菌存活率

式中：N0、N分别为UV-C照射前、照射处理t时间（min）后活菌的数量（CFU/mL）。

1.3.4 霉菌致死率

1.4 预测微生物失活模型构建

1.4.1 Bigelow模型

假设微生物（细胞或孢子）对致死处理都具有相同的抗逆性，其灭活规律符合一级动力学模型，即Bigelow 模型[13-14]：

式中：k为一级线性模型灭活速率常数，min-1；D值（decimal reduction time，十进制减少时间）为90%致死所需要的时间，min；t为UV-C照射时间，min。

1.4.2 Modified Gompertz模型

Bhaduri提出Modified Gompertz模型用于拟合微生物失活曲线，Xiong为避免在多次试验中直接使用不同的初始值，将Bhaduri的模型进行了重新整理，方程如下[15-16]：

式中：M为霉菌达到最大绝对死亡率所用的时间，min；B为霉菌在最大绝对死亡率下的相对死亡率，（CFU/mL）/min；C 为上下渐近线的差值；μmax为最大死亡速率；t为UV-C照射时间，min。

1.4.3 Log-Logistic模型

Log-Logistic模型可用于描述微生物灭活动力学，经过Chen的重新排列，其方程为[17]：

式中：A为失活曲线最高和最低渐近线的差值；σ为微生物最大失活率，%；τ表示微生物最大失活率对应的时间对数值；t为UV-C照射时间，min。

1.4.4 Weibull模型

该模型假设微生物（细胞和孢子）对致死处理具有不同的抗性，失活曲线是致死因子分布的累计形式，则灭活时间遵循Weibull分布，其方程为[18]：

式中：α 是比例因子，min；β是形状因子，β<1 时存活率曲线呈凹形，β>1时存活率曲线呈凸形，β=1时存活率曲线呈线性（等于Bigelow模型）；t为UV-C照射时间，min。

1.5 模型评价

检验一个模型是否适合拟合试验所得数据，可以通过模型统计指标来进行评价。决定系数（coefficient of determination，R2）、根均方误差（root-mean-square error，RMSE）、残差平方和 （sum of squares for error，SSE）都是评价模型优劣的指标，R2越大，RMSE、SSE越小，模型的拟合度越好。

1.6 曲线拟合

采用结合麦夸特法（Levenberg-Marquardt）、通用全局优化法的优化算法，利用1stOpt 1.5对数据进行非线性回归得出模型参数。

2 结果与分析

2.1 芒果黑曲霉、烟曲霉的生长曲线

黑曲霉、烟曲霉的生长曲线见图1。

图1 黑曲霉、烟曲霉的生长曲线Fig.1 The growth curve of A.niger and A.fumigatus

由图1可知，黑曲霉在0～8 h时，生长曲线趋势比较平缓，此时黑曲霉处于生长停滞期，同理，烟曲霉的生长停滞期位于0～20 h之间。处在停滞期的黑曲霉、烟曲霉需要适应新生长环境并进行自身调整，其繁殖速度非常缓慢。不同的真菌在同一环境条件下其生长速度存在一定的差异，这是因为不同真菌在悬浮培养过程中由于对新环境的适应能力不同以及生产代谢不同，因此其生长情况也不尽相同。可见，芒果黑曲霉比烟曲霉对新环境的适应能力更强，能较快地适应新的生长环境，从而快速地生长繁殖，度过停滞期的时间比烟曲霉更短。黑曲霉在8 h～70 h、烟曲霉在20 h～76 h为对数生长期，此时真菌已经适应了环境，培养基中的营养物质非常充足，生长环境及条件也很好，生长率以几何级数增加。黑曲霉在70 h～106 h进入稳定期，而烟曲霉的稳定期为76 h～124 h。在这段时间里，生长环境变差，培养基中的营养物质被不断地消耗，pH值下降，菌体的毒性代谢产物不断积累，使得繁殖速度逐渐下降，进入一个短暂的稳定期，最后进入衰亡期。

郝曼等[19]研究黑曲霉在察氏液体培养基中的生长期分为3个阶段：停滞期（0～35 h），对数生长期（35 h～65 h），稳定期（65 h以后）；张晋卿等[20]的研究中，烟曲霉在酵母浸膏培养基中生长最快，对数生长期约开始于12 h～20 h，到约60 h时进入第二生长过渡期；在酵母氮源基础培养基中菌株直到约60 h时才进入对数生长期。在上述研究中，黑曲霉、烟曲霉的生长曲线与本研究时间虽不尽相同但差距较小，其原因是由于所采用的培养基不同而导致。处在对数生长期的真菌，其酶系活跃，代谢旺盛，细胞的形态、化学组成和理化性质基本一致，对外界具有较强的抵抗能力，对数生长后期活菌数与总菌数基本接近，因此选择对数生长后期的真菌进行UV-C照射，以此来探讨UV-C对真菌的灭活规律。

2.2 UV-C照射时间对黑曲霉、烟曲霉杀菌效果的影响

UV-C照射时间对黑曲霉、烟曲霉杀菌效果和致死率见图2、表1。

图2 UV-C照射时间对黑曲霉、烟曲霉杀菌效果的影响Fig.2 Effect of the UV-C treatment time on the inactivation of A.niger and A.fumigatus

表1 黑曲霉、烟曲霉UV-C处理的致死率Table 1 Survival models parameters of A.niger and A.s fumigatus treated by UV-C

出口芒果一般会进行蒸热处理，使果心温度达到47℃，相对湿度>95%，处理20 min，以达到有效的害虫检疫要求[21]。此外，还有研究表明，对红贵妃芒果进行50℃热水处理10 min～20 min后迅速冷却至25℃，风干后用PE保鲜袋包装后置于12℃恒温箱（RH为90%）中贮藏，能极显著地抑制病情指数的上升[22]。因此，对水果果实进行短时热激处理，除了达到检疫要求，还能提高其抗病性，但不能杀灭病原菌。这是因为对芒果进行热处理的温度一般在50℃及以下，然而黑曲霉、烟曲霉的致死温度远高于该温度。郭建伟等[4]对从云南河口、蒙自采后的芒果病果中分离获取的黑曲霉进行生物学特性研究，其菌丝生长最适温度为30℃，致死温度为55℃，产孢最适温度为32℃，致死温度为60℃；烟曲霉被认为是一种耐热真菌，这种特性使其对环境变化的抵抗力更强，在酵母浸膏培养基中，最适生长温度为37℃，最高生长温度为52℃，65℃处理180 min或70℃处理120 min可以杀灭烟曲霉[20]。如果想要杀灭黑曲霉、烟曲霉，需要提高芒果热处理温度，但过高温度处理又会对芒果产生热伤害，造成表皮发黑、快速腐烂[23]。由此可见，UV-C用于灭活芒果表面黑曲霉、烟曲霉的优势较热激处理明显，UV-C处理既能起到果实表面杀菌作用，同时还能诱导果实增强抗病性，从而抵御病原菌的伤害。

由图 2 可知，在 0～179 min（0～15.04 kJ/m2）内，随着UV-C处照射时间的延长，照射剂量的增加，黑曲霉、烟曲霉的存活率对数也随之下降，UV-C对这两种真菌的杀灭效果逐渐增强。相同照射时间下，烟曲霉的存活率对数下降较快；在UV-C照射60 min（5.04 kJ/m2）时，烟曲霉存活率下降了1.92个数量级，黑曲霉的存活率下降了1.47个数量级；当照射时间到179 min（15.04 kJ/m2）时，黑曲霉、烟曲霉的存活率分别下降了2.47、2.83个数量级。因此，烟曲霉对0～15.04 kJ/m2范围内的UV-C较为不耐受。对于黑曲霉而言，在0～60 min（0～5.04 kJ/m2）内时，黑曲霉存活率对数下降较快；60 min～89 min（5.04 kJ/m2～7.48 kJ/m2）时，增加 UV-C剂量，其存活率对数变化较小，甚至趋于平缓。照射时间增加到 89 min～179 min（7.48 kJ/m2～15.04 kJ/m2）时，黑曲霉存活对数有所下降，但速度逐渐减慢，119 min～179 min（9.98 kJ/m2～15.04 kJ/m2）时，其存活率仅下降了0.19个数量级。由此可见，在一定条件下，UV-C对霉菌的灭活效果是一定的，它不会随着照射剂量的增加而继续增加，达到一定的灭活程度后，其灭活效果变化不大。对于烟曲霉而言，烟曲霉存活率曲线的斜率在89 min（＜7.48 kJ/m2）前较大，随着UV-C照射时间的进一步延长，其斜率却逐渐减小，其存活率对数虽然也有所下降，但不如89 min前快。由表1可知，随着UV-C剂量的增加，黑曲霉和烟曲霉的致死率也随之增加，在2.52 kJ/m2时，黑曲霉和烟曲霉的致死率均在90%以上。

UV-C具有很强的生物活性，尤其是在254 nm，通过诱导单链断裂，形成共价连接的胸腺嘧啶二聚体，抑制转录和复制，直接破坏DNA，从而导致细胞损伤，对微生物具有杀灭作用[24-25]。与黑曲霉相比，烟曲霉对UV-C的抗性较弱，Nourmoradi的研究中，相同剂量的UV分别照射黑曲霉、烟曲霉，烟曲霉的存活率对数到达4个数量级，而黑曲霉才下降到3个数量级，同样证实了黑曲霉比烟曲霉更耐受UV[26]。真菌耐受UV，主要是由于真菌的分生孢子细胞壁上附着的黑色素，黑色素是一种高分子量色素，由多种酚类和吲哚类单体组成，能提高真菌在UV、氧化剂和电离辐射等恶劣环境中的生存能力，其吸收UV和清除自由基，可屏蔽UV且消除UV产生的自由基从而保护真菌免受紫外线杀灭[27-29]，60 min～89 min时黑曲霉的存活率对数变化较小，甚至趋于平缓，极大可能是由于黑色素对黑曲霉的保护作用。然而随着照射时间的延长，黑色素因氧化而分解，保护能力被削弱，黑曲霉存活率对数又继续下降。黑曲霉比烟曲霉更耐受UV，可能是由于两者黑色素的合成途径有差异。虽然他们都是主要通过1，8-二羟基萘（dihydroxynaphthalene，DHN）合成途径合成黑色素[30]，但烟曲霉的合成有关酶类是由6种基因编码，因此可能会导致合成黑色素的能力存在差距[31]。

2.3 UV-C致死历程的数学模型分析

黑曲霉、烟曲霉UV-C灭活模型的模型参数见表2。Bigelow模型是最为经典的杀菌线性模型，由图2可知，黑曲霉、烟曲霉随着照射时间的延长，失活曲线并非呈线性关系，表明UV-C作用下2种霉菌的残存率变化与照射时间之间并非是明显的线性关系，这也说明了不同菌、同种菌的不同个体对UV-C的敏感程度存在着个体差异性，导致致死速率不一致。用Bigelow模型对霉菌失活曲线进行拟合，得到模型参数与评价指标（表2），黑曲霉、烟曲霉的Bigelow模型相关系数R2在0.82～0.85之间，回归系数较低，RMSE和SSE较大，回归曲线对试验值的拟合情况较差；因此Bigelow模型不适合用于描述分析UV-C照射条件下黑曲霉、烟曲霉的致死规律。

表2 黑曲霉、烟曲霉UV-C灭活模型的模型参数Table 2 Survival models parameters of A.niger and A.s fumigatus treated by UV-C

Modified Gompertz模型对黑曲霉、烟曲霉的失活曲线进行拟合，相关系数R2都在0.92以上，RMSE和SSE指标较小，说明该模型能较好地拟合黑曲霉、烟曲霉的失活曲线，其中烟曲霉的模型参数R2最大，说明模型回归系数较高，RMSE和SSE较小，模型拟合的残差值分布更集中，因此该模型拟合最优为烟曲霉。代表最大死亡速率的μmax，数值上等于BC/e，由此可以看出，烟曲霉细胞对UV-C更敏感。

Log-Logistic模型对黑曲霉、烟曲霉的失活曲线进行拟合，相关系数R2都在0.94以上，RMSE和SSE指标最小，该模型能较好地拟合黑曲霉、烟曲霉的失活曲线，其中模型拟合最优为烟曲霉。由于不同霉菌对UV-C照射的敏感程度不同，所以模型参数值的大小各异。τ表示微生物最大失活率对应的时间对数值，黑曲霉、烟曲霉的τ值分别为13.15、1.99，烟曲霉最大失活率对应的时间最短，最易被杀灭。

Weibull模型对黑曲霉、烟曲霉的失活曲线进行拟合，相关系数R2都在0.94以上，RMSE和SSE指标较小，说明该模型能较好地拟合这两种霉菌的失活曲线，其中模型拟合最优为烟曲霉。β代表失活曲线的形状，当β＜1时失活曲线是凹面，β=1时失活曲线是一条直线，当β＞1时失活曲线是凸面。黑曲霉、烟曲霉的形状因子β分别为0.47、0.40，均小于1，说明2种霉菌的失活曲线为凹面，再次验证了UV-C照射黑曲霉、烟曲霉的失活曲线并不符合一级动力学模型。曲线为凹面，随着照射时间的延长，存活率对数下降减缓趋势，黑曲霉、烟曲霉对UV-C的抗性逐渐增强。

黑曲霉最优模型排序为：Weibull模型>Log-Logistic模型>Modified Gompertz模型>Bigelow模型；烟曲霉最优模型排序为：Log-Logistic模型>Weibull模型>Modified Gompert模型>Bigelow模型。由此可见，4个模型都不能同时对黑曲霉、烟曲霉的试验值表现出最佳的拟合效果，但Log-Logistic模型和Weibull模型表现更优异，适用性更强。

3 结论

以百色地区芒果检出率较高的黑曲霉、烟曲霉为研究对象，研究UV-C对黑曲霉、烟曲霉的致死影响，研究发现，黑曲霉、烟曲霉在接受UV-C不同时长的照射后，其存活率对数呈下降趋势；烟曲霉对0～15.04 kJ/m2范围内的UV-C较为不耐受；黑曲霉对UV-C的耐受能力大于烟曲霉，0～15.04 kJ/m2范围内黑曲霉的存活率对数虽然总体下降，但在5.04 kJ/m2～7.48 kJ/m2范围内其对UV-C的耐受能力有所增强。在2.524 kJ/m2时，黑曲霉和烟曲霉的存活率对数下降1.1个数量级、致死率均在90%以上。

应用Bigelow模型、Modified Gompertz模型、Log-Logistic模型和Weibull模型对经UV-C照射后黑曲霉、烟曲霉的存活数据进行拟合，并通过R2、RMSE、SSE这3个统计指标比较4种模型的拟合优度。结果显示，黑曲霉、烟曲霉随着照射时间的延长，其失活曲线并非呈线性关系，Bigelow模型为线性模型，并不适合描述该失活规律；黑曲霉最适模型为Weibull模型；烟曲霉最优模型为Log-Logistic模型。

最终，黑曲霉最佳UV-C失活模型为：

烟曲霉最佳UV-C失活模型为：

利用以上灭活模型可预测不同UV-C处理时间下黑曲霉、烟曲霉的存活动态变化，模型精度高，预测准确，可以大大节约时间成本。通过这两个模型，可以在已知芒果果实黑曲霉、烟曲霉的初始活菌数量，以及最终需要达到的黑曲霉、烟曲霉存活率对数的安全范围内，来计算UV-C的处理时间，从而以最短的处理时间达到灭活目的，又可以减少因为处理过度而引起的果蔬贮藏性的变化。