香蕉内生细菌G9R-3分离鉴定及其拮抗香蕉枯萎病菌活性评价

周 维，田丹丹，李朝生，覃柳燕，韦 弟，韦绍龙，刘挺燕，黄素梅

(广西农业科学院生物技术研究所/香蕉抗病种质创制与病虫害防控联合实验室，广西 南宁 530007)

【研究意义】由尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种(Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace 4，Foc4)引起的香蕉枯萎病(Fusariumwilt)是目前世界上危害香蕉产业健康发展的最严重病害[1]。已有研究表明，选育和种植抗病品种结合生物防治已成为防控香蕉枯萎病最切实可行的策略及方法之一[2-3]。桂蕉9号是广西首个自主选育的抗枯萎病香蕉新品种[4]，但其抗性等级为中等，重病区种植还存在抗性不足等问题，利用该品种的内生菌资源是开发其配套生物防控菌剂是目前解决该问题的重要途径。内生菌与宿主存在互利共生关系，产生的活性物质能诱导或增强宿主植物对病虫害及逆境胁迫的抗性[5-6]。因此，分离鉴定香蕉内生细菌并进行拮抗香蕉枯萎病菌活性评价，对利用香蕉内生菌资源防控香蕉枯萎病具有重要意义。【前人研究进展】张科立[7]、戴英葵等[8]从香蕉植株中分离到具有拮抗Foc4活性的内生劳尔氏菌BEB3及BEB99，二者均能产生铁载体并能提高香蕉植株的枯萎病防效。田丹丹等[9]、陈博等[10]、王宇光等[11]分别从香蕉植株中分离到的内生解淀粉芽孢杆菌、类芽孢杆菌和阴沟肠杆菌菌株均能促进香蕉植株生长，降低枯萎病对蕉苗的危害。张建春等[12]研究显示，内生荧光假单孢菌UPMP3和伯克霍尔德菌UPMB3能诱导香蕉感病品种产生Foc4抗性。杨秀娟等[13]研究发现，内生枯草芽孢杆菌EBT1培养液活性物质能显著提高香蕉组培丛生芽的增殖率并提升植株SOD、PAL、POD和PPO等防御酶活性。桑建伟等[14]研究表明，内生菌回接不同抗性香蕉品种，其定殖量及相对防效存在显著差异。吴蔼民等[15]研究了内生菌73a在不同抗性品种棉花体内的定殖和消长动态。马凤娟等[16]研究发现，接种生防菌XP1能提高香蕉根际土壤细菌物种丰富度和有益菌比例,有效防控大田香蕉枯萎病的发生。【本研究切入点】G9R-3菌株的菌体、发酵液及挥发性气体均对香蕉枯萎病菌(Foc4)有较强抑制作用，但目前关于该菌株抑菌机制及防控枯萎病效果的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】分离鉴定桂蕉9号植株根部内生细菌G9R-3并分析其抑菌机制，回接不同品种香蕉并评价其防效，为开发利用该菌株配套抗病香蕉品种防控枯萎病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株香蕉枯萎病病原菌Foc4、香蕉品种桂蕉1号和桂蕉9号香蕉组培盆栽苗均由广西农业科学院生物技术研究所提供；红研2号和万钟4号香蕉组培盆栽苗由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。供试培养基参考方中达[17]的方法使用LB和PDA培养基，菌株生理生化试验所用试剂参考东秀珠和蔡妙英[18]《常见细菌系统鉴定手册》中的试剂。仪器设备：BIOMETRAT professional PCR仪(德国耶拿)，UVI FireReader 凝胶成像仪(英国UVItec)。

1.2 试验方法

1.2.1 内生细菌分离、筛选及鉴定 采用三步消毒法[18]分离健康香蕉植株根部内生细菌，利用平板对峙法筛选其中具有拮抗香蕉枯萎病病原菌活性的菌株。菌株形态学观察及生理生化特性参考东秀珠和蔡妙英[18]《常见细菌系统鉴定手册》中的方法 进行分析。参考陈奕鹏[20]的方法进行分子鉴定及16S rDNA 和gyrB基因序列PCR扩增，然后进行测序并构建系统发育进化树。

1.2.2 内生细菌平板拮抗Foc4活性评价 配制PDA固体培养基培养病原菌Foc4并制备菌饼，配制NA固体培养基培养内生细菌。将Foc4菌饼(D=5 mm)置于 PDA 培养基中央，在距离其两侧2.5 cm 处用接种环挑取供试内生细菌单菌落进行划线培养，3 次重复，以不接种拮抗内生细菌的Foc4生长情况为对照，28 ℃恒温培养7 d后，用游标卡尺测量拮抗带宽度，计算平板菌落抑制率。菌落抑制率(%)=(对照生长直径-处理拮抗带直径)/(对照生长直径-菌饼直径)×100。

1.2.3 内生细菌发酵液对 Foc4菌落生长的影响 按照1.2.2的方法制备Foc4菌饼，LB摇瓶培养制备内生细菌发酵液，0.22 μm滤膜过滤菌体，以发酵液1∶1000接种到未凝固PDA培养基中混匀，待培养基凝固后制备带毒平板。将Foc4菌饼(D=5 mm)置于带毒平板中央，3次重复，以未加细菌发酵液的PDA平板为空白对照，28 ℃恒温培养7 d后，十字交叉法测定Foc4菌落直径，计算菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-对照菌饼直径)×100。

1.2.4 内生细菌挥发性气体对Foc4菌落生长的影响 制备Foc4菌饼备用，采用平板对扣法[20]检测内生细菌挥发性气体抑菌作用。在NA培养基平板表面涂布100 μl供试菌株孢子悬浮液，在PDA平板中央接种Foc4菌饼(D=5 mm)。NA平板在下，PDA平板在上，两平板对扣后用封口膜封闭，3次重复，以空白NA平板为对照，28 ℃恒温培养7 d后，十字交叉法测定Foc4菌落直径，计算菌丝生长抑制率。

1.2.5 内生细菌回接不同香蕉品种盆栽苗防效评价 选取生长一致的4个香蕉品种(桂蕉1号、桂蕉9号、红研2号和万钟4号)健康盆栽杯苗，采用常规水肥管理。参照桑建伟等[14]的方法，各取30株香蕉苗用灌根法接种内生细菌发酵液(浓度为1×106CFU/mL，100 mL/株)，每隔10 d接种1次，共接种3次，以不接种内生细菌发酵液的植株为空白对照。最后一次接种内生细菌发酵液10 d后伤根接种107CFU/mL的Foc4孢子悬浮液，60 d后调查植株发病情况。参照农业行业标准(NY/T2248-2012)计算病情指数和进行病害分级。

平均发病率(%)=各处理发病株数/调查总株数×100

病情指数=[∑(各级病株数×该病级)]/(调查总株数×最高病级) ×100

相对防效(%)=(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100

2 结果与分析

2.1 内生细菌的分离、筛选和鉴定

从桂蕉9号植株根部分离得到一株内生细菌，通过平板对峙试验筛选得到具有较强拮抗香蕉枯萎病菌Foc4活性的菌株G9R-3；菌株经革兰氏染色呈阳性，杆状，产芽孢，在NA培养基上菌落呈圆形，边缘不规则，表面光滑湿润(图1)，呈淡黄色。其生理生化特性检测结果见表1。PCR扩增菌株G9R-3的16S rDNA序列全长为1427 bp，在NCBI上进行BLAST比对，结果与B.amyloliquefaciens、B.velezensis和B.subtilis序列相似度均在99 %以上(图2)。选取相应菌种模式菌株序列构建系统发育进化树，菌株G9R-3与B.velezensisSQR9、B.amyloliquefaciensFZB42聚在同一分支，亲缘关系较近。为进一步确认其亲缘关系，采用PCR扩增菌株G9R-3gyrB基因序列与相应菌种模式菌株序列进行BLAST比对，结果(图3)表明，该菌株基因序列全长为1265 bp，与B.amyloliquefaciensFZB42相似度最高，达99 %，聚于同一分支，亲缘关系更近。综合以上序列比对结果，将菌株G9R-3鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

图1 菌株G9R-3的平板菌落形态Fig.1 Colony morphology of strain G9R-3

表1 菌株G9R-3生理生化特性

图2 基于16S rDNA序列构建的系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

图3 基于gyrB基因序列构建的系统发育进化树Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on gyrB gene sequence

2.2 菌株G9R-3平板的拮抗Foc4活性分析

从图4可看出，以划线法评价菌株G9R-3拮抗Foc4活性，7 d后检测抑菌带宽度为1.34 cm，对照Foc4菌落的直径为6.84 cm，通过计算得到菌株G9R-3对Foc4菌落的抑制率为83.05 %。说明菌株G9R-3菌体在平板上具有较强的抑制Foc4菌落生长活性。

图4 菌株G9R-3平板的拮抗Foc4效果Fig.4 Antagonistic effect against Foc4 of strain G9R-3 plate

2.3 菌株G9R-3发酵液的拮抗Foc4活性分析

从图5可看出，以带毒平板生长速率法评价菌株G9R-3发酵液拮抗Foc4活性，7 d后测量Foc4菌落在发酵液平板上的直径为5.33 cm，对照Foc4菌落的直径为9.24 cm，经计算菌株G9R-3发酵液对Foc4菌丝生长的抑制率为42.35 %。说明菌株G9R-3发酵液中存在抑制Foc4菌丝生长的活性物质。

图5 菌株G9R-3发酵液对Foc4生长的抑制作用Fig.5 Growth inhibition of Foc4 by fermentation broth G9R-3

2.4 菌株G9R-3挥发性气体的拮抗Foc4活性分析

平板对扣法评价结果(图6)表明，菌株G9R-3挥发性气体处理平板上Foc4菌落的直径为3.75 cm，对照Foc4菌落的直径为9.06 cm，经计算挥发性气体对Foc4菌丝生长的抑制率为58.64 %。说明菌株G9R-3产生的挥发性气体具有较强的抑制Foc4菌丝生长活性。

图6 菌株G9R-3挥发性气体对Foc4生长的抑制作用Fig.6 Growth inhibition of Foc4 by volatile gas G9R-3

2.5 G9R-3回接不同香蕉品种盆栽苗的相对防效

由表2可知，不同香蕉品种先接种G9R-3、再接种Foc4后，香蕉枯萎病发病率及病情指数均显著降低(P<0.05)，表明G9R-3能有效提升各香蕉品种对枯萎病的抗病性；各香蕉品种的相对防效排序为桂蕉1号>桂蕉9号>红研2号>万钟4号，其中接种菌株G9R-3后感病品种桂蕉1号的发病率由对照的90.00 %降至36.67 %，病情指数由87.94降至30.78，相对防效达65.00 %；抗病品种中，G9R-3接种红研2号的相对防效为29.91 %，接种万钟4号的相对防效为16.11 %，而接种桂蕉9号的效果最佳，发病率由33.33 %降至13.33 %，病情指数由23.57降至12.06，相对防效达48.83 %。

表2 内生细菌G9R-3回接不同香蕉品种盆栽苗的抗病性表现

3 讨 论

内生菌具有在宿主体内定殖的特性，能有效发挥其与宿主互利共生的作用，分离、利用香蕉内生菌防控枯萎病是目前香蕉枯萎病研究的热点之一[21-22]。

内生菌的主要生防机制包括生态位竞争、活性物质拮抗和诱导植物免疫反应等[23-24]。柴庆凯等[25]研究发现，解淀粉芽孢杆菌LJ02能诱导黄瓜产生β-1,3葡聚糖酶和几丁质酶破坏病菌细胞壁，还能通过POD诱导植株产生木质素和酚类物质抵抗病害侵染，提高黄瓜对灰霉病菌的抗性。Deleu等[26]研究认为内生芽孢杆菌产生的表面活性素虽无直接抗真菌活性但能增强伊枯草菌素的抗真菌能力，能在植物根部表面形成生物膜，阻止病原菌入侵。刘端木等[27]从赤豆(Vignaangularis)中分离得到抑制赭曲霉和黄曲霉生长的拮抗细菌 SC-B15，能产生抑菌蛋白。在香蕉枯萎病防控方面，朱森林等[28]、田丹丹等[9]利用香蕉内生解淀粉芽孢杆菌BEB33、GKT04回接香蕉，获得良好的生防效果。桑建伟等[14]报道，香蕉内生解淀粉芽孢杆菌BEB17在不同抗性品种上的定殖量及防效存在差异，内生菌更容易在感病品种上定殖，产生的脂肽类物质能抑制枯萎病菌生长。周维等[29]研究发现，G9R-3发酵液产生的脂肽类化合物能破坏Foc4 细胞膜并引起菌丝肿大和畸形，并抑制其孢子萌发。本研究从抗病品种桂蕉9号植株根部分离得到一株内生解淀粉芽孢杆菌(菌株G9R-3)，通过接种不同抗枯萎病香蕉品种(抗性表现为桂蕉9号>万钟4号>红研2号>桂蕉1号)，发现其能提高盆栽抗、感病香蕉品种的防治效果，其中与桂蕉1号和桂蕉9号的亲和性更高，接种防效更佳，可能与菌株G9R-3在桂蕉1号和桂蕉9号中的定殖量较大有关。

内生菌在植株体内的有效定殖是提高枯萎病防效的关键[30]。吴蔼民等[15]报道内生菌更易于在感病品种中定殖，本研究还需进一步探明菌株G9R-3在香蕉植株上的定殖规律。此外，本研究的菌株G9R-3分离自桂蕉9号，回接防效试验结果较优，因此，抗病香蕉品种的抗病性与菌株G9R-3种群的相关性也需要进一步探究。

4 结 论

从抗病品种桂蕉9号健康香蕉植株根部分离得到的一株内生细菌G9R-3，鉴定为解淀粉芽孢杆菌，其菌体、发酵液及挥发性物质均具有拮抗香蕉枯萎病菌Foc4的活性，能提高盆栽抗、感病香蕉品种的防治效果。