小檗胺联合拉帕替尼对三阴性乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

朱激扬 陈华 徐燕芳

[摘要] 目的 研究小檗胺联合拉帕替尼对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响。 方法 MTT法检测不同浓度的小檗胺和拉帕替尼单独用药及联合用药对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖抑制作用;采用CompuSyn软件分析不同剂量组联合用药的联合指数CI，确定最佳联合方案;将细胞随机分为4组：空白对照组、小檗胺组、拉帕替尼组以及联合用药组，用筛选出的最佳联合剂量分别进行药物干預，流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。 结果 相对于单独用药，小檗胺和拉帕替尼联合用药能够更加显著地抑制MDA-MB-231细胞增殖，差异有统计学意义（P < 0.05）;CompuSyn软件分析结果显示各个剂量联合用药的CI值均<1，表明两药具有协同抑制的作用，选择CI值最小的剂量组进行后续实验;与空白对照组比较，小檗胺组与拉帕替尼组细胞总凋亡率增加，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），与小檗胺组和拉帕替尼组比较，联合用药组细胞总凋亡率增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 小檗胺联合拉帕替尼能够增强对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖抑制作用以及诱导凋亡作用。

[关键词] 小檗胺;拉帕替尼;三阴性乳腺癌;增殖;凋亡

[中图分类号] R737.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）07（b）-0123-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of Berberine combined with Lapatinib on proliferation and apoptosis of MDA-MB-231 triple negative breast cancer cells. Methods MTT assay was used to detect the proliferation inhibition of single application for Berberine， Lapatinib and drug combination at different concentrations in MDA-MB-231 triple negative breast cancer cells. CompuSyn software was used to analyze the combined index CI of different dose groups and determine the best combined scheme. The cells were randomly divided into 4 groups： the blank control group， the Berberine group， the Lapatinib group and the drug combination group， and the optimal combination dose selected was used for drug intervention respectively. Flow cytometry was used to detect apoptosis in each group. Results Compared with the single drug， the combination of Berberine and Lapatinib inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells more significantly， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. CompuSyn software analysis results showed that the CI value of each combined dose was < 1， indicating that the two drugs had synergistic inhibitory effect. The dose group with the lowest CI value was selected for subsequent experiments. Compared with the the blank control group， the total apoptosis rate of the Berberine group and the Lapatinib group increased， and the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with the Berberine group and the Lapatinib group， the total apoptosis rate of the combined treatment group was increased， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Berberine combined with Lapatinib can enhance the ability of the proliferation inhibition and induce apoptosis of MDA-MB-231 triple negative breast cancer cells.

[Key words] Berberine; Lapatinib; Triple negative breast cancer; Proliferation; Apoptosis

三阴性乳腺癌是指雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）表達均为阴性的乳腺癌，其恶性程度高，侵袭性强，容易出现局部复发和远端转移[1]，占所有乳腺癌的15%～23%[2-3]。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是ErbB酪氨酸激酶受体家族的成员，在细胞迁移和侵袭方面发挥重要作用[4-5]。拉帕替尼（Lapatinib）作为EGFR的靶向抑制剂，单独使用时的临床疗效不太理想[6-8]。有研究称[7]，拉帕替尼和伊马替尼联合使用双靶向抑制EGFR和c-Abl能够有效抑制三阴性乳腺癌细胞的生长。小檗胺（Berbamine）是从小檗属植物中提取的双苄异喹啉类生物碱，同样作为c-Abl的抑制剂[9-10]，其与拉帕替尼联合使用治疗三阴性乳腺癌的研究还鲜有报道。因此，本研究通过体外培养人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231，分析小檗胺和拉帕替尼单独用药与联合用药对MDA-MB-231细胞增殖的影响，寻找最佳联合方案，并选用流式细胞仪观察联合用药对细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞

人乳腺癌细胞MDA-MB-231购自中国科学院上海生命科学学院细胞库。

1.2 药材、试剂与仪器

小檗胺（上海诗丹德生物技术有限公司，批号：1933;纯度>98.0%），用DMSO配制成50 mmol/L储存备用;拉帕替尼（GSK，批号：J20180012）;DMEM、胎牛血清（Gibco公司，批号：13100056、1725107）;MTT试剂盒（碧云天，批号：C0010）;Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒（Thermo公司，批号：BMS500F1-201）;超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，SW-CJ-2FD）;流式细胞仪（Calibur DB，USA）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养  MDA-MB-231细胞株培养于含10%的胎牛血清、青霉素200 U/mL、链霉素200 U/mL的完全培养液DMEM中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。每2天换液1次，待80%～90%融合后，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3传代，置37℃、5%CO2培养箱内继续培养用于后续实验。

1.3.2 MTT法检测小檗胺与拉帕替尼单独及联合用药对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用  取对数期生长的MDA-MB-231细胞，消化、离心后加入适量培养基重悬细胞，血球计数板计数后，接种至96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，并控制其细胞浓度为3000个/孔，于培养箱中培养18 h至贴壁后，每孔加入10 μL药物，设置小檗胺浓度梯度为0、15、20、25、30 μg/mL，设置拉帕替尼浓度梯度为0、2、4 μg/mL，每个浓度设置4个复孔，另外设置空白对照组，培养48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，4 h后每孔加入200 μL三联液，将96孔板放到外用37℃恒温培养箱中作用18 h后，用Bio-Rad酶标仪在570 nm条件下测定吸光度OD值，计算单独用药和联合用药对细胞的抑制率和细胞的相对存活率。

1.3.3 联合指数及等效线分析法  MTT法检测单独用药及联合用药对MDA-MB-231细胞生长抑制率，并将计算得到的存活率用联合用药软件CompuSyn分析处理，得到的等效线图是基于小檗胺与拉帕替尼的计量-反应曲线，其中在等效线下方的数据点提示药物间有协同作用;在等效线上的数据点提示药物间属于叠加作用;在等效线上方的数据点提示药物间有拮抗作用。

1.3.4 AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡  实验分组：空白对照组、小檗胺组、拉帕替尼组、联合用药组。将状态良好的MDA-MB-231细胞以6×105/孔传代于6孔板中，等待细胞贴壁之后，按照分组的情况加入药物，药物浓度由CompuSyn软件分析筛选得到，每组设置3个复孔，继续培养24 h后用磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗2遍，用胰酶消化后，用PBS重悬细胞，离心后加入1×Binding buffer 500 μL重悬细胞成细胞悬液，分别加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，避光孵育10 min，采用guava微流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间分析采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小檗胺与拉帕替尼单独及联合用药对MDA-MB-231细胞增殖的影响

小檗胺和拉帕替尼均能抑制MDA-MB-231细胞增殖，并且与单独用药比较，两药物联合用药能够显著增强对MDA-MB-231细胞的抑制率，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 CompuSyn软件分析联合指数

根据MDA-MB-231细胞在不同浓度的小檗胺和拉帕替尼单独及联合作用下的存活率，用CompuSyn软件分析得到等效线图及联合方案的联合指数CI。所有剂量组联合用药数据点均在等效线下方，且CI值均<1，提示两药具有协同作用。其中在拉帕替尼4 μg/mL，小檗胺为25 μg/mL时，CI值最小，即联合效果最佳，以此为最佳联合方案进行后续实验。见图1。

2.3 小檗胺与拉帕替尼单独及联合用药对MDA-MB-231细胞凋亡的影响

采用AnnexinV/PI双染色法检测小檗胺（25 μg/mL）与拉帕替尼（4 μg/mL）单独及联合用药对MDA-MB-231细胞凋亡的影响。空白对照组、小檗胺组、拉帕替尼组及联合用药组的凋亡率分别为5.88%、13.9%、20.33%、27.67%。与空白对照组比较，小檗胺组与拉帕替尼组及联合用药组细胞总凋亡率增加，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），与小檗胺组和拉帕替尼组比较，联合用药组细胞总凋亡率增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

3 讨论

肿瘤分子靶向治疗是指在肿瘤分子生物学和细胞生物学的基础上，针对可能导致细胞癌变的环节，从分子水平上来逆转这种恶性生物学行为，从而抑制肿瘤细胞生长，甚至使其完全消退的一种全新的生物治疗模式[11]。EGFR在细胞迁移和侵袭方面发挥着重要的作用，并在肺癌、卵巢癌、乳腺癌和结直肠癌等恶性肿瘤中高表达[12-15]。拉帕替尼是同时靶向EGFR和HER2的小分子口服酪氨酸激酶抑制剂，研究显示，拉帕替尼与化疗药物联用对食管癌、胃癌及胃食管连接癌均表现出较好的抗肿瘤活性[16]，但在临床试验中发现，拉帕替尼单独使用时的临床疗效却不太理想[6-8]。非受体酪氨酸激酶c-Abl是一个多功能的原癌基因蛋白，它可以调节细胞的迁移、氧化应激反应以及凋亡。研究显示[17-18]，在乳腺癌發病机制中，c-Abl表达是一种常见的现象，它在乳腺癌细胞的生长和侵袭中扮演了重要的角色，且与乳腺癌晚期的转移密切相关，伊马替尼是目前应用最广泛的c-Abl抑制剂。有文献报道[7]，拉帕替尼和伊马替尼联合使用双靶向抑制EGFR和c-Abl能够有效抑制三阴性乳腺癌细胞的生长。小檗胺作为c-Abl的一个天然抑制剂[9]，由此推测，小檗胺联合拉帕替尼也能够抑制三阴性乳腺癌细胞的生长。

小檗胺具有多种生物学功能，包括促进白细胞增生、抗结核、抗心肌缺血缺氧、抗心律失常等[19]，近来有报道称它可明显抑制多种恶性肿瘤的细胞增殖，包括白血病细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、乳腺癌细胞等[20]。本研究结果显示，相比于单独用药，小檗胺与拉帕替尼联合用药能够更加有效地抑制三阴性乳腺癌的生长，通过生物信息软件证实两药物呈现协同抑制作用，并筛选出最佳联合方案，流式细胞术证明联合用药能够更显著地诱导MDA-MB-231细胞的凋亡。本研究提出了一种联合用药新思路，并为三阴性乳腺癌的临床用药提供了可能的指导。

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（收稿日期：2020-01-06）