膜苞鸢尾不同极性部位的抗炎活性研究

2020-08-27常利华南禧辰张曼瑞赵劲竹严敏杨阳

生物化工 2020年4期

常利华，南禧辰，张曼瑞，赵劲竹，严敏，杨阳

（西安医学院药学院，陕西西安 710000）

炎症是具有血管系统的活体组织对各种损伤因子的刺激所产生的防御反应，临床表现为红、肿、热、痛等症状。目前在改善炎症的药物中，合成的化学抗炎药均具有明显的不良反应，而天然药物具有资源丰富、疗效确切、副作用小等优点，故成为当前研究热点[1-2]。

膜苞鸢尾（Iris scariosaWilld .exLink）属于鸢尾科鸢尾属植物，主要分布于新疆等地区，其根状茎和根是新疆中草药镰叶马蔺根的药材基源，具有清热解毒、利咽等功效，可治疗癌症、炎症、细菌和病毒感染等多种疾病[3-4]。膜苞鸢尾中分离得到的天然产物以黄酮为主，而黄酮的抗炎活性是其最主要的生物活性之一[5]。鸢尾属植物根及根状茎在世界上许多国家和地区都被用于治疗炎症相关疾病，但目前尚未有文献报道过其对活化巨噬细胞炎性递质生成的影响。

本实验通过脂多糖（LPS）刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞系建立炎症细胞模型[6]，检测从膜苞鸢尾根状茎提取分离得到的5种不同极性部位对炎症模型细胞中炎症介质NO分泌量的影响[7-8]，为后续分离纯化具有抗炎活性的天然产物以及进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

膜苞鸢尾的根及根状茎采自新疆察布查尔锡伯自治县，经北京师范大学生命科学学院植物分类学教授刘全儒鉴定为鸢尾科鸢尾属植物膜苞鸢尾（Irisscariosa Willd. exLink）；RAW264.7细胞，购自中国北京协和细胞资源中心。

1.2 仪器与试药

Multiskkango1510全波长酶标仪，ThermoScientific；MCO-15AC型CO2恒温培养箱，日本Sanyo公司；SW-CJ-1F型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；Ti-u型倒置显微镜，日本Nikon公司；UV-1780紫外分光光度计，日本岛津公司；BS124S电子天平，北京赛多利斯天平有限公司。

脂多糖（LPS），Sigma公司；二甲基亚砜（DMSO），99.7%，MkSeal；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT），纯度≥98.0%，上海沪震实业有限公司；DMEM培养基、胎牛血清，北京协和细胞资源中心；NO检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；鸢尾苷标准品（批号：JZ15020119），南京景竹生物科技有限公司，HPLC≥98%。

1.3 膜苞鸢尾提取物溶液的制备

1.3.1 膜苞鸢尾不同极性部位提取物的制备

取膜苞鸢尾药材粉碎，过20目筛，储于干燥器中备用。将药材粉末分别加入到石油醚（沸程30～60）、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水中，料液比1∶30（g∶mL），于温度40 ℃、功率450 W下超声提取30 min，布氏漏斗抽滤2次，50 ℃左右减压浓缩至膏状，4 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 提取物溶液配制

称取膜苞鸢尾根及根状茎的正丁醇极性部位、水极性部位、二氯甲烷极性部位、乙酸乙酯极性部位和石油醚极性部位，在1 mL EP管中用适量的DMSO溶解并制成200 μg/mL的工作液，现用现加10%FBS的DMEM培养基稀释成所需浓度，控制DMSO量在千分之一以下。

1.4 膜苞鸢尾提取物抗炎活性试验

1.4.1 细胞培养与分组设计

RAW264.7细胞培养于含100 U/mL双抗、10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中孵育生长，隔日传代。取对数生长期的RAW264.7细胞180μL，接种于96孔培养板。按照表1进行试验设计，每个给药组设置3个给药浓度，每个浓度3个复孔，各孔加入10 μg提取物溶液，各孔终体积用DMEM培养基补充至200 μL。试验中，以无细胞的培养基（处理0）为空白组，加细胞的培养基（处理1）为正常对照组。

表1 试验设计

1.4.2 MTT法检测提取物对细胞活力的影响

将表1中各组细胞于37 ℃、5% CO2条件下孵育24 h后，吸走细胞培养上清液，每孔加入100 μL浓度为5 mg/mL的MTT，培养4 h后，弃掉细胞上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡器上轻摇10 min，结晶溶解后，立即比色测定。空白组（处理0）调零后，用全波长酶标仪在490 nm波长处测出细胞对照组和各实验组的吸光度A。根据公式1计算细胞存活率。

式中，A给药组为处理2～6的吸光度数值，A空白为处理0的吸光度数值；A正常对照组为处理1的吸光度数值。

1.4.3 Griess法测定提取物对RAW264.7细胞NO释放的影响

LPS可以刺激诱导RAW264.7细胞产生多种与炎症相关的递质和细胞因子，从而建立炎症细胞模型。因此，用LPS诱导的RAW264.7炎症细胞代替表1中2～6组的正常细胞进行试验，并设置未给药的LPS诱导RAW264.7炎症细胞作为模型对照组。

在炎症反应中，NO是炎症反应与免疫调节的效应因子和调节因子。NO参与多种炎症信号转导，与多种炎症因子互相作用。NO在炎症反应每一阶段都有产生，NO的过量产生与炎症密切相关，而抑制NO生成则是抗炎活性的直接指标[9-10]。用NO检测试剂盒按照说明书要求进行标准曲线的绘制，得到标准曲线为Y=0.007 7X+0.073 8，r=0.998 4。将表1中各组细胞于37 ℃、5% CO2条件下孵育24 h后，每孔取50 μL上清液按照NO检测试剂盒说明书的要求进行测定，根据标准曲线得到NO浓度。

2 结果与分析

2.1 RAW264.7细胞活力测定结果

采用MTT法检测膜苞鸢尾不同极性部位对RAW264.7炎症细胞活力的影响，结果如图1显示。当石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和水部位在质量浓度为5～20 μg/mL范围内，作用于RAW264.7炎症细胞24 h，给药组细胞的存活率均大于100%，且在5 μg/mL和15 μg/mL浓度下可刺激RAW264.7细胞增殖，差异具有统计学意义（P＜0.001）。正丁醇部位在质量浓度为50～200 μg/mL范围内，给药组细胞的存活率大于100%，且在50 μg/mL和100 μg/mL浓度下可刺激RAW264.7细胞增殖，差异具有统计学意义（P＜0.001）。实验结果表明，本实验浓度范围内膜苞鸢尾的不同极性部位对细胞均无毒性作用。

2.2 RAW264.7炎症细胞NO生成量测定结果

在确定膜苞鸢尾不同极性部位的无毒性剂量范围后，研究了膜苞鸢尾不同极性提取物对LPS诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞NO生成量的影响，结果如图2所示。当细胞未受到外界LPS刺激时，细胞基本不表达NO；在终浓度为1 μg/mL的LPS刺激24 h后，细胞NO含量明显上升，差异具有统计学意义（P＜0.001），表明LPS刺激RAW264.7巨噬细胞后，能诱导细胞释放大量炎性介质NO。经过膜苞鸢尾不同极性部位作用后，巨噬细胞中NO的释放受到不同程度的抑制，且5种提取物的抑制作用均呈现出剂量依赖效应。当药物浓度为5～20 μg/mL时，石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、水部位NO生成量明显降低（P＜0.001）。当浓度为5 μg/mL时，抑制NO的效果为石油醚部位＞乙酸乙酯部位＞二氯甲烷部位＞水部位；当药物浓度为15 μg/mL时，抑制NO的效果为乙酸乙酯部位＞二氯甲烷部位＞石油醚部位＞水部位；当药物浓度为20 μg/mL时，抑制NO的效果乙酸乙酯部位＞二氯甲烷部位＞石油醚部位＞水部位。当药物浓度在50～200 μg/mL时，正丁醇部位才能够显著抑制炎症模型细胞中NO的生成，说明正丁醇部位抗炎效果最差。