快速检测Y染色体微缺失方法的建立

杨神州

（复旦大学 生命科学学院，上海 200438）

据世界卫生组织报道，全球约1/10的育龄期夫妇不能正常生育后代，主要原因之一是男性因素引起的不育[1]。Y染色体微缺失是男性不育的原因之一[2]。

目前Y染色体AZF微缺失检测的方法很多。欧洲男科学会（EAA，European Academy of Andrology）和欧洲分子基因诊断质量联盟（EMQN，European Molecular Genetics Quality Network）发布了Y染色体微缺失的分子诊断指南，指出对特异性标签位点（STS，Sequence tagged sites）进行扩增具有简单、快速、灵敏、特异的特点，是检测AZF缺失的理想方法[3]。目前，多重定性PCR法和实时荧光定量PCR都是基于检测STS来确定是否有已知的缺失，该方法操作简单，检测周期相对较短[4-5]，但需要DNA提取等过程。

近年来，出现了很多核酸恒温扩增技术，如核酸依赖性扩增检测、环介导恒温扩增、链替代扩增、滚环扩增、依赖解旋酶的恒温基因扩增及转录介导的扩增技术等，反应时间短、特异性好、不需复杂仪器设备等特点是传统PCR难以超越的[6-7]。相对其他核酸恒温扩增技术来说，重组酶聚合酶扩增（RPA，Recombinase Polymerase Amplification）技术具有不需热变性、引物设计相对较简单、在25～42 ℃恒温条件下可快速完成核酸扩增等诸多优点[8]。RPA技术已经应用于医学检测、病原微生物、食品安全等多个领域[9]。

1 材料与方法

1.1 材料

收集4名志愿者的血液样本，其中男女各2名。这4名志愿者中，2名男性均无7个STS（sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255、sY14）缺失，女性均无以上STS。

1.2 试剂和仪器

天根基因组DNA提取试剂盒；Chelex-100，北京索莱宝；通用一步法DNA提取液，上海生工；2×GoldStar Best MasterMix PCR扩增试剂，康为世纪；RPA试剂，TwistDx公司。

ABI2720 PCR仪，Applied Biosystems；NanoDrop 2000超微量分光光度计，Thermo Fisher，用于测定A260/230和A260/A280以及核酸浓度。

1.3 实验引物

引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，PCR引物序列参考EAA和EMQN发布的Y染色体微缺失分子诊断指南。RPA引物根据RPA引物设计原则设计，具体设计原则为：5′端3～5个核苷酸避免聚鸟嘌呤（G），最好为胞嘧啶（C）；3′端3个核苷酸是G或C，有助于聚合酶的稳定性；不要出现聚嘌呤和嘧啶；GC含量在30%～70%；避免形成二级结构、发卡结构等；靶标区域避开重复元件，引物序列见表1

1.4 裂解条件

裂解条件1：5 μL血液样本中加入45 μL 5 mmol/L的NaOH溶液，90 ℃孵育2 min。

裂解条件2：5 μL血液样本中加入45 μL溶液A（NaOH浓度为5 mmol/L，Chelex-100浓度为5%），90 ℃孵育 2 min。

裂解条件3：5 μL血液样本中加入45 μL通用一步法DNA提取液，80 ℃加热2 min。

1.5 反应体系与反应条件

PCR反应体系条件参考EAA和EMQN发布的Y染色体微缺失分子诊断指南。

RPA反应体系为25 μL，包括2×Reaction Buffer 12.5 μL，10 mmol/L dNTPs 4.6 μL，10×Basic E-mix 2.5 μL，10 μmol/L引物A和10 μmol/L引物B各1.2 μL，20×Core Reaction 1.25 μL，混匀后加入1.25 μL的280 mmol/L MgOAc和1 μL DNA模板。39 ℃反应30 min。

1.6 产物的检测

取5 μL PCR产物于1.5%三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺（TAE）电泳缓冲液琼脂糖中电泳，200 V电泳25 min。

RPA产物中加入25 μL三羟甲基氨基甲烷-乙二胺缓冲液（TE buffer），混匀后98 ℃孵育1 min。取5 μL产物用1.5% TAE琼脂糖电泳，200 V电泳25 min。

2 结果与讨论

2.1 裂解条件的选择

裂解和提取的DNA经Qubit和紫外分光光度计检测，浓度和检测结果如表2所示。裂解条件1和裂解条件2提取浓度差别不大，浓度最高；天根试剂盒提取浓度次之，裂解条件3提取浓度最低。A260/230和A260/A280显示天根试剂盒提取的DNA纯度最高，裂解条件1～3得到的DNA纯度较低。

表1 STS引物列表

表2 不同提取方法的浓度和吸光度

图1显示不同提取方法提取血液DNA经过选用sY255引物组进行RPA扩增之后电泳的条带。结果显示，裂解条件1、裂解条件2、天根试剂盒提取后扩增产物清晰可见，极易辨别，裂解条件3的扩增产物有微量条带出现，血液直接为模板的扩增无产物出现。考虑到裂解条件2中的Chelex-100极易沉降，在实际检测中不方便，所以在后续实验中选择条件1进行检测。

图1 不同提取方法的扩增产物电泳图

2.2 引物特异性检测

男性和女性血液样本按照裂解条件1裂解后，分别取1 μL作为模板进行RPA扩增，正常男性样本每个STS都扩增出了清晰的目的条带，而正常女性样本均未见目的条带，凝胶图像见图2。

图2 引物特异性检测电泳图

3 结论

使用快速碱裂解法提取DNA，并没有经过酶解、洗涤等过程，证明了血液通过该方法可以快速地用于RPA，解决了血液样本对RPA抑制这一问题。该研究进一步将Y染色体微缺失检测和RPA结合，证明在操作简单、仪器需求程度低的情况下，核酸裂解仅需2 min，扩增不超过30 min，产物变性和电泳不超过27 min，1 h内即可检测出结果，实现了Y染色体微缺失的快速检测。