前列腺癌相关超级增强子RNA鉴定及调控功能分析

2020-08-27庞盼盼

生物化工 2020年4期

庞盼盼

（复旦大学生命科学学院，上海 200438；上海生物芯片有限公司，上海 201203）

随着基因芯片、高通量二代测序等技术的迭代更新，科学家们从不同物种内鉴定发现的非编码RNA（noncoding RNA，NcRNA）目录也越来越丰富[1]，人类基因组中可转录成非编码RNA的部分远远超过蛋白质编码基因的部分，长链非编码RNA（longnoncodingRNA，lncRNA）[2]是其中非常重要的一员，通常长度超过200个碱基且不翻译成蛋白质。已有研究发现，lncRNA在细胞的不同层面中调控发育和病变等多种生物学进程，包括转录调控、染色质结构调控、蛋白质或RNA分子的调控[3-4]。除了根据lncRNA长度、转录特性分类，lncRNA还可以根据lncRNA位点含有的特殊DNA调控元件分类，有增强子lncRNA、启动子相关ncRNA、3′-UTR相关RNA 等[5]。

本文通过定制基因芯片和可获取的公共数据库，在芯片中鉴定出14213个超级增强子相关lncRNA（super enhancer-associated lncRNA，SE-lncRNA）；进一步筛选得到292个在前列腺癌中差异表达的SE-lncRNA。荧光定量PCR验证部分潜在调控SE-lncRNA及编码基因，结果与芯片完全吻合。结合生物信息学手段，通过对超级增强子及其靶基因启动子进行转录因子预测分析，构建了一个SE-lncRNA-转录因子-靶基因三元调控网络。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂

总RNA核酸抽提试剂盒（#217004）、DNA酶消化试剂盒（#79254）、R核酸纯化试剂盒（#74106），QIAGEN公司；安捷伦RNA质检胶条（#5067-5576）、安捷伦RNA质检缓冲液（#5067-5577）、低起始量全转录组单标试剂盒（#5190-2943）、标准品Spike-In（#5188-5282）、表达谱芯片杂交试剂盒（#5188-5242）和表达谱芯片洗涤试剂盒（#5188-5327），Agilent公司；无核酸酶水（#AM9937）、组织保存液（#AM7021），Ambion公司；无水乙醇（#A500737），SangonBiotech公司；氯仿（#0757-500 mL），Amresco公司；高效率逆转录试剂盒（#FSQ-101），TOYOBO公司；SYBRGreen荧光定量试剂盒（#4367659），ABI公司；TRIzol裂解液（#15596026），美国ThermoFisher公司；DEPC焦碳酸二乙酯（#B600154 ），上海生工生物工程股份有限公司；RNeasy mini Kit核酸纯化试剂盒（#74106），德国QIAGEN公司。

1.2 样本

3例前列腺癌患者的肿瘤组织及配对正常癌旁组织，手术所取样本立即装入含组织保存液的冻存管中，样本管在4 ℃环境下孵育过夜，然后转移到-20 ℃存贮。

1.3 抽提

前列腺癌组织的RNA提取。（1）将小块组织用手术刀片切成薄片，置于1.5 mL离心管中，加入300 μL TRIzol，将离心管置于冰上，用组织研磨器对组织进行充分研磨，按照研磨30 s、冷却30 s的研磨频率进行。（2）研磨之后按照细胞RNA提取方法进行RNA的抽提，裂解液置于冰上充分裂解细胞5 min后，加200 μL氯仿，震荡混匀30 s，室温放置5 min。4 ℃、12 000 r/min离心15 min，转移上层水相到新的离心管中。加入500 μL异丙醇，颠倒混匀多次，-20 ℃静置10 min（为了提升提取效率可放置1～2 h），4 ℃、12 000 r/min离心15 min。弃上清，加1 mL 75%的乙醇清洗残留的有机溶液，4 ℃、12 000 r/min离心10 min。小心吸除上清液，保留RNA沉淀。空气干燥10～15 min。加适量DEPC处理过的水溶解，测OD260/OD280并计算RNA浓度。电泳检测RNA的完整度。可置于-80 ℃长期保存，RNA应尽快使用，避免反复冻融。

1.4 基因芯片制作

1.4.1 总RNA的扩增与荧光标记

应用Agilent低起始量快速扩增基因表达标记试剂盒扩增和标记样品的完整转录本。以提取的总RNA为模板，经随机引物反转录合成cDNA，再经Cy3荧光标记获得cRNA。

1.4.2 标记效率质检

标记后的cRNA经RNeasy mini kit纯化后，使用NanoDrop的微阵列检测功能，通过cRNA（ng/μL）和Cy3（pmol/μL）浓度来计算荧光插入率。

1.4.3 芯片杂交、洗涤与扫描

应用Agilent Gene Expression Hybridization Kit，取1.65 μg标记后cRNA配制片段化和杂交反应液。使用上海生物芯片有限公司的SBC Human ceRNA Array表达谱芯片，最终合成的芯片在滚动杂交炉中，65 ℃杂交17 h。杂交完成后取出芯片，应用Gene Expression Wash Buffer Kit在洗缸中洗涤芯片。芯片经洗涤后，“Agilent”面朝上放进片夹，盖上防臭氧的盖子。立即扫描以最大限度降低臭氧影响，避光密封保存。

1.5 实时定量PCR

cRNA的反转录按照TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit反转录试剂盒说明书进行，在0.2 mL PCR管中配制反应溶液，体系如下：5×RTBuffer 2.0 μL、RTEnzyme Mix 0.5 μL、Primer Mix 0.5 μL、Ttoal RNA 1 μg，然后用RNase free H2O补足至总体积20 μL。振荡混匀短暂离心后，置于PCR仪内，设置温度为37 ℃（15 min）、98 ℃（5 s）完成反转录反应，4 ℃保存。

以反转录得到的cDNA为模板，进行SYBR Green qPCR实验，在0.2 mL PCR管中配制反应液，体系如下：2×SYBR Green PCR buffer 10 μL、Forward primer（10 μmol/L）0.5 μL、Reverse primer（10 μmol/L）0.5 μL，Template 10 ng，然后用RNase free H2O补足至总体积20 μL。实时定量PCR仪器使用ABI7500，运行程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；溶解曲线。每个样品重复检测3次，检测结果取平均值。采用相对threshold cycle（△△Ct）方法计算相对表达水平，mRNA和lncRNA定量以β-actin作为内参基因校准。

2 结果与分析

2.1 前列腺癌相关SE-lncRNA鉴定

dbSUPER是最早的超级增强子数据库，其利用ENCODE、GEO等公共数据库中H3K27acCHIP-seq数据，先采用MACS识别增强子，再使用ROSE软件鉴别出超级增强子，并补充了文献报道的超级增强子。Super-Enhancer Archive数据库在此基础上有所补充。下载dbSUPER和Super-Enhancer Archive两个数据库数据，并进行整合获得超级增强子库。而SBClncRNA芯片收录SE-lncRNA和mRNA较全面，整合了 NCBI、Genecode、Noncode、LNCipedia等多个数据库。对前面获得的超级增强子库与芯片lncRNA进行比对，鉴定出14 213条超级增强子RNA。进一步利用SBClncRNA芯片，分析了3对前列腺癌患者的癌和癌旁样本的lncRNA、SE-lncRNA和mRNA表达谱，利用PCA对样本分组进行评估，结果与生物学分组相符（图1A和图1B）。原始数据用R软件中的limma包归一化处理后，采用2倍Fold-change以及T检验统计学方法对差异基因进行筛选，得到差异表达SE-lncRNA和mRNA。共鉴定到292个前列腺癌相关的差异表达SE-lncRNA和1 220个差异表达mRNA。差异表达SE-lncRNA和mRNA热图（图1C和图1D）、火山图（图1E）展示了芯片整体差异情况。对差异SE-lncRNA的长度和染色体位置进行了统计分析，长度小于2 000 nt的差异SE-lncRNA占比为77.39%，而其在各染色体分布比较均一（图1F和图1G）。

2.2 SE-lncRNA靶基因预测及功能分析

虽然大多数SE-lncRNA在基因表达调控中的作用尚不清楚，但其被认为是功能活性增强子的标志。有研究表明[6]，SE-lncRNA可能辅助超级增强子起到顺式调控作用。为进一步分析、预测SE-lncRNA潜在功能和机制，利用超级增强子在细胞中起到顺式作用的原理，根据染色体物理位置关系将临近基因作为显著差异表达SE-lncRNA的靶基因。芯片同时设计了mRNA检测探针，可以允许筛选SE-lncRNA靶基因的表达变化。SE-lncRNA及其靶基因共同差异变化且变化趋势相同时，被认为SE-lncRNA对其靶基因具有潜在顺式调控作用。筛选到188个顺式调控关系，这其中包含139个SE-lncRNA和155个靶基因。

目前认为SE-lncRNA主要起到转录调控作用，那么其靶基因的功能也就能预测出SE-lncRNA可能的调控方向。接下来对差异SE-lncRNA靶基因进行了GSEA富集分析，基于GSEAhallmarks数据集的通路分析结果显示，主要激活了MYC靶基因、雄激素应答、DNA修复、胆固醇动态平衡、氧化磷酸化、E2F靶基因、mTORC1信号通路和G2M检查点等通路，抑制了凋亡、KRAS信号通路、组织缺氧、干扰素应答和雌激素反应延迟等通路。被激活和抑制富集程度最高的3个通路如图2A～2F所示。利用Fisher精确检验对差异SE-lncRNA靶基因进行了GO富集分析，鉴定显著富集功能894条，其中生物学过程相关691条，细胞成分相关119条，分子功能相关84条。显著富集的40条通路如图2G所示，主要涉及激素调控和染色质结构等。

图1 前列腺癌种差异表达基因的筛选

2.3 SE-lncRNA与mRNA共表达分析

图2 GSEA和GO分析预测SE-lncRNA靶基因的功能

SE-lncRNA除了能够顺式调控，也有文章报道其具有反式调控作用。为预测SE-lncRNA反式调控靶向基因，采用了共表达分析。共表达分析是根据SE-lncRNA及mRNA的信号值，通过共表达计算方法构建网络帮助发现SE-lncRNA与mRNA之间可能存在的作用关系，筛选共表达网络正相关的关系对，能够找到影响mRNA表达的SE-lncRNA（图3）。通过分析共找到1 962个反式调控关系，节点连接数（degree）最高的5个SE-lncRNA为NONHSAT249416、ENST00000623545、NONHSAT118924、NONHSAT162106和ENST00000445427。

4.4 三元调控网络构建，预测SE-lncRNA调控机制

SE-lncRNA转录子超级增强子区域的功能很有可能是协助超级增强子调控基因转录，采用Homer算法对JASPAR（http://jaspar.genereg.net/）数据库中转录因子结合motif在SE-lncRNA转录子相关超级增强子和靶基因启动子进行预测，并筛选具有相同转录因子结合motif的SE-lncRNA-靶基因关系对，在这个关系对中SE-lncRNA可能协助其超级增强子调控转录因子与靶基因启动子结合，从而调控基因转录。进一步构建SE-lncRNA-转录因子-靶基因三元调控网络，有助于从全转录组层面理解前列腺癌中SE-lncRNA参与的调控网络（图4）。其中degree最高的5个SE-lncRNA为NR_038892、NONHSAT151931、NONHSAT108683、NONHSAT158683和 NR_003191。

4.5 qRT-PCR验证SE-lncRNA和mRNA

为了验证前期的发现，利用qRT-PCR进行验证。挑选了 3个 SE-lncRNA（ ENST00000431144、NONHSAT252076、ENST00000608741）和2个前列腺癌相关的编码基因（AR、TNFAIP3）进行验证。实验显示，qRT-PCR结果和芯片检测的结果是一致的。NONHSAT252076和AR在芯片和qRT-PCR结果中均为上调，ENST00000431144、ENST00000608741和TNFAIP3均为下调（图5），这证明了前面结果的可靠性。

图3 SE-lncRNA与mRNA共表达网络图

图4 SE-lncRNA-转录因子-靶基因三元调控网络

图5 前列腺癌差异表达lncRNA和mRNA的qRT-PCR验证

通过对超级增强子和其靶基因启动子进行转录因子预测分析，如果他们具有相同转录因子结合motif，这部分SE-lncRNA极有可能参与其相关增强子与靶基因启动子空间构象的维持，调控转录，并构建了调控网络。NR_038892是调控网络中degree最高的SE-lncRNA，也是CBR3反义链的一个非编码转录本，在此次研究结果中CBR3没有显著差异变化，其潜在显著差异变化的靶基因包括顺式靶基因DOPEY2和反式靶基因KLK12、RAB3D、BST1、PALD1，其中KLK12和BST1已有文献报道[7]和前列腺癌相关。为了证明芯片及数据挖掘结果的可靠性，利用qRT-PCR验证部分潜在调控SE-lncRNA及编码基因，结果与芯片完全吻合，这证明SE-lncRNA在前列腺癌发生发展中确实起到了调控作用。