营养缺陷型大肠杆菌高产L-苏氨酸的研究

周泉钱，朱长俊，杜雨桐，罗奋杰，钱广

（嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江嘉兴 314001）

苏氨酸（Threonine）是一种重要的营养强化剂，有恢复人体疲劳、促进生长发育的效果。在医药上，由于苏氨酸的结构中含有羟基，对人体皮肤具有保湿作用，在体内还能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。目前，生产L-苏氨酸的主要方法是大肠杆菌发酵法。草酰乙酸是L-苏氨酸的前体，而大肠杆菌的草酰乙酸主要来源于三羧酸循环[1]，在此循环中天冬氨酰半醛（Aspartyl semialdehyde）和L-高丝氨酸（L-Homoserine）会分别生成副产物L-赖氨酸（L-Lysine）和L-甲硫氨酸（L-Methionine）。通过化学诱变后筛选出赖氨酸缺陷型大肠杆菌（Lys菌株）和赖氨酸、甲硫氨酸双重缺陷型[2]大肠杆菌（Met-Lys菌株），该菌株的L-赖氨酸和L-甲硫氨酸支路途径被阻断，干路途径的碳流量增加，从而使L-苏氨酸的产量增加。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli），本实验室保存。

试剂：按文献[3-4]配制5%（V/V）的硫酸二乙酯乙醇溶液（DES）；pH=6.9磷酸缓冲盐溶液（PBS）0.100 mol/L；25%（V/V）硫代硫酸钠溶液；L-苏氨酸标准溶液1.630×10-4mol/L；四氯对苯醌乙醇溶液3.000×10-3mol/L；硼砂溶液0.100 mol/L。

器材：UV-1100紫外分光光度计，济南千司生物技术有限公司；SBA1243电子分析天平，哈尔滨德远科技开发有限公司；Eppendorf 5810R离心机，深圳市德优平科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化及培养基种类

保存菌种进行划线分离，37 ℃恒温倒置培养24 h。

培养基种类：种子培养基；基本培养基；二倍氮源高渗培养基；赖氨酸补充培养基；甲硫氨酸、赖氨酸补充培养基；大肠杆菌发酵培养基[5]。实验流程图如图1所示。基本培养基、赖氨酸补充培养基及甲硫氨酸与赖氨酸补充培养基分别用MM、[Lys]、[Met、Lys]表示。

图1 实验流程图

1.2.2 测定生长曲线及致死曲线

取15个150 mL锥形瓶，按计划的培养时间长短分别编号为 0、1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、K（K为空白对照组，其余编号数字代表培养小时数）。每个锥形瓶中加入20 mL肉汤培养基，并按1%接种量接种0.2 mL种子液；K组和“0”组接种完成后立即于600 nm处测定吸光度并记录数据，其余组37 ℃、180 r/min恒温震荡培养，相应时间到达后取出测定吸光度，处理数据并绘制生长曲线图[6]。

取11组1.5 mL的EP管，分别添加不同量的5%DES（0～100 μL，以10 μL的量递增），并用PBS定容至1.5 mL，诱变时长为15 min（从加入5% DES起到加入25%硫代硫酸钠溶液终止），取1.0 mL处理液加入1.0 mL 25%（V/V）硫代硫酸钠溶液终止诱变，然后各组取0.1 mL涂布于肉汤固体培养基上，3个平行，37 ℃倒置培养12 h，菌落计数，绘制致死曲线，计算公式如式1所示。

1.2.3 菌种诱变

Lys菌株的诱变：采用30 μL/mL菌悬液的比例进行诱变，诱变时长为15 min，诱变结束按照5%的接种量，移取2.5 mL处理液接种至50 mL[Lys]液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养24 h，然后制成同体积的菌悬液。Met-Lys菌株的诱变过程同上，扩增培养的培养基改为50 mL[Met、Lys]液体培养基[7]。

1.2.4 筛选目标菌株

取0.1 mL经淘汰、纯化后的菌悬液涂布于[Lys]平板，涂布6个平板；37 ℃倒置培养24 h。从[Lys]平板上挑取72个菌落，对应点植至MM平板和[Lys]平板上；经培养后挑取在[Lys]平板上生长情况比MM平板好的菌株作为疑似菌株。将其编号，进行复检，分别在[Lys]平板和MM平板上进行划线，连续培养5代，比较第5代的菌株在[Lys]平板与MM平板上的生长情况，若[Lys]平板上的菌株生长情况比MM平板的好，则说明该菌株是可以稳定遗传的Lys菌株。

Met-Lys菌株的筛选：除涂布平板进行相应的变化，大致过程同上，获得稳定遗传的Met-Lys菌株。

1.2.5 发酵及L-苏氨酸产量的测定

按照5%的接种量分别将普通大肠杆菌、赖氨酸缺陷型和赖氨酸、甲硫氨酸双重缺陷型大肠杆菌的菌悬液接入20 mL发酵培养基中，每组3瓶，37 ℃、180 r/min培养48 h[8-9]。发酵结束后，将发酵液4 000 r/min离心20 min，取上清液稀释500倍，准确移取1.0 mL稀释液置于10 mL容量瓶中，加0.5 mL硼砂溶液（0.100 mol/L）和1.5 mL四氯苯醌溶液（0.003 mol/L），用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，置50 ℃水浴40 min，水流冷却至室温，以相同方法制备试剂空白为参比，石英比色皿在352 nm处测吸光度A，求出L-苏氨酸的含量[10-12]。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌生长曲线和5% DES致死曲线的测定

由图2可知，实验室保存大肠杆菌在2 h内生长缓慢，2～6 h为对数生长期。5% DES对大肠杆菌具有很强的致死作用，如图3所示，添加量为30 μL时，致死率达到71.03%；添加量为50 μL时，致死率接近100%。在菌种的DES诱变过程中，要求致死率为70%～80%是最佳的诱变条件，因此，选取30 μL作为5% DES的添加量，进行大肠杆菌的菌种诱变。

图2 大肠杆菌生长曲线图

2.2 营养缺陷型菌株的筛选

根据不同平板上菌落的生长情况可以初步筛选出疑似Lys菌株和Met-Lys菌株，然后进行下一步检测，初筛结果如图4所示。圈出的菌落在第2排的平板上的生长情况均比第1排的平板要好，因此可知圈出的菌落为疑似营养缺陷型菌株。

图3 大肠杆菌5% DES致死曲线图

图4 营养缺陷型菌株的初筛结果

2.3 营养缺陷型菌株的复检

如图5所示，通过比较不同平板上疑似菌株的生长情况，可以发现营养缺陷型菌株在营养补充型培养基上的生长情况比MM培养基上要好的多，由此便可以确认筛选出了营养缺陷型菌株。

图5 营养缺陷型菌株的复检结果

表1 营养缺陷型菌株与普通大肠杆菌菌株的L-苏氨酸产量

2.4 营养缺陷型菌株稳定性检测

连续培养5代后，可以发现Lys菌株和Met-Lys菌株都能较好地稳定遗传。

2.5 L-苏氨酸产量测定

如表1所示，Lys菌株的L-苏氨酸产量比普通大肠杆菌增加了26.01%，达到了4.07 g/L；Met-Lys菌株比普通菌株增加了299.38%，达到了12.90 g/L。结合胡丹等人[13]的研究发现，此次诱变出来的Met-Lys菌株比其使用的工程菌L-苏氨酸的产量（1.80 g/L）提高了6.17倍。

3 结论

赖氨酸缺陷型大肠杆菌和赖氨酸、甲硫氨酸双重缺陷型大肠杆菌均可以有效提高L-苏氨酸的产量，赖氨酸缺陷型大肠杆菌的L-苏氨酸产量比普通大肠杆菌增加了26.01%；赖氨酸、甲硫氨酸双重缺陷型大肠杆菌比普通大肠杆菌增加了299.38%。虽然选育出的单一营养缺陷型的突变株可以有效提高L-苏氨酸的产量，但是与双重突变株相比仍然存在一定的差距。本实验仅是通过化学诱变选育了双重营养缺陷型突变株，从而提高L-苏氨酸产量。接下来的研究可通过改变发酵条件或是加快L-苏氨酸的胞外分泌速度减弱L-苏氨酸反馈抑制，来进一步提高L-苏氨酸的产量。