UHPLC法测定不同产地雷公藤饮片中雷公藤甲素和红素的含量*

葛丹丹，高家荣，鲍学梅，杨满琴，徐 倩，苏 毅

(1 安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥 230061；2 安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230061；3 安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥 230061)

药用雷公藤饮片系卫矛科植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)的干燥根皮。性：苦，有大毒。其主要功效有活血通络、祛风除湿、消肿定痛等[1]。现代研究表明雷公藤在治疗风湿及类风湿性关节炎、抗肿瘤、糖尿病性肾病的肾脏保护[2-4]等方面具有确切疗效。雷公藤甲素与雷公藤红素是雷公藤有效成分。雷公藤甲素可通过抑制糖尿病大鼠肾组织RANTES的过度表达，从而改善肾间质的纤维化和肾小球功能[5]；亦可诱导急性T淋巴细胞性白血病的细胞凋亡而治疗白血病[6]；同时，雷公藤甲素可抑制小鼠乳腺癌细胞4T1的增殖，此抗增殖作用与其降低ERα、ERβ的磷酸化密切相关[7]。雷公藤红素对脑缺血后血管和细胞重生具有保护作用[8]；也可治疗诸如卵巢癌[9]等肿瘤。对高糖诱导的大鼠糖尿病心肌病的心肌H9C2细胞具有抑制作用从而发挥对心肌细胞的保护作用[10]。目前，雷公藤饮片在诸多方面已经得到非常广泛的应用，但在市场上不同来源、产地、加工及储存方法等的差异导致饮片的质量亦有所不同，进而影响其临床疗效。因此，本研究运用UHPLC技术对不同产地雷公藤饮片中雷公藤甲素和雷公藤红素的含量进行测定，以期为进一步研究提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪 器

1290 InfinityⅡUHPLC 色谱仪，Agilent Technologies；DK-S24电热恒温水浴锅，上海三发科学仪器有限公司；BP211D型十万分之一天平，德国Sartorius公司；XFB-200 高速中药粉碎机，中国吉首市中州制药机械厂。

1.2 试 药

雷公藤甲素对照品(批号：111567，纯度为99.8%)，中国食品药品检定研究院；雷公藤红素对照品(批号：111946，纯度为97.0%)，中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他均为分析纯。

雷公藤饮片分别购自湖北、广东等地，经安徽中医药大学第二附属医院鲍学梅主任鉴定为卫矛科雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)的根。来源见表1。

表1 雷公藤饮片来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm ×100 nm，1.7 μm)；流动相：乙腈(B)-0.1%磷酸水(A)，梯度洗脱：0～2 min，95% B；2～12 min，88%B；12～17 min，85%B；17～26 min，76%B；26～44 min，40%B；44～49 min，20%B；49～55 min，5%B；55～56 min，95%B。流速：0.5 mL/min；进样量：5 μL；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃。在此色谱条件下，雷公藤甲素与雷公藤红素与其他色谱峰均可达到有效分离，雷公藤甲素的理论塔板数为58328，雷公藤红素的理论塔板数为609362，均符合要求。雷公藤甲素与雷公藤红素的分离度>1.5，符合《中国药典》中的规定。空白溶剂对含量测定无干扰，如图1所示。其中，雷公藤甲素为1号峰、雷公藤红素为2号峰。

图1 UHPLC色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取雷公藤甲素及雷公藤红素对照品适量置于10 mL的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制得质量浓度为0.115 mg/mL和0.137 mg/mL的雷公藤甲素与雷公藤红素对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取各产地雷公藤饮片，干燥后打成粉(过三号筛)。取药材粉末10 g至锥形瓶中，加甲醇-乙腈(1∶2，V/V)150 mL水浴回流提取2 h，再次称定质量，补足减失的质量。过滤，取滤液浓缩近干。加甲醇20 mL使溶解，过SPE中性氧化铝柱，用二氯甲烷-甲醇(7∶3)50 mL洗脱，收集洗脱液浓缩至干，用甲醇溶解并稀释定容至10 mL容量瓶中，作为供试品溶液。进样前过0.22 μm微孔滤膜。

2.3 线性关系考察

精密吸取配制好的对照品储备液适量，将其稀释到一定浓度，用甲醇配制7个浓度梯度的对照品溶液，按上述“2.1项”色谱条件进样测定，记录色谱峰面积，以对照品浓度为横坐标(X)，色谱峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归分析，得雷公藤甲素的回归方程为：Y=807211X-40938(R2=0.9994)；雷公藤红素的回归方程为：Y=939678X-54915(R2=0.9991)。雷公藤甲素与雷公藤红素的线性范围分别为0.23～115 μg/mL、0.137～27.4 μg/mL。

2.4 精密度试验

分别精密吸取上述对照品溶液，照“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，测定色谱峰面积，结果雷公藤甲素的RSD为1.67%，雷公藤红素的RSD为2.53%。符合精密度要求，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

称取湖北产雷公藤药材粉末6份，每份10 g，按上述供试品溶液制备方法制备，按“2.1项”下色谱条件进行进样测定，测定色谱峰面积并计算各样品含量。结果，雷公藤甲素含量的RSD为1.34%；雷公藤红素含量的RSD为2.26%。表明本方法的重复性良好。

2.6 稳定性试验

精密称取湖北产同一批雷公藤饮片，按上述“2.2”项下条件制备供试品，分别于0、2、4、8、12、24 h后，照“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。计算雷公藤甲素和雷公藤红素RSD分别为2.15%和3.24%，表明供试品溶液在24 h内保持稳定。

2.7 加样回收率试验

取湖北产雷公藤药材粉末6份，每份10 g，精密称定，分别精确加入与雷公藤药材含量等量的雷公藤甲素对照品0.5130 mg和雷公藤红素对照品0.5850 mg，按上述“2.2”项下条件制备供试品溶液，再按上述“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算平均加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收率试验结果(n=6)

2.8 样品含量测定

分别取湖北、福建、云南、广东四个产地雷公藤药材粉末各3份，每份约10 g，照上述供试品溶液制备方法制备供试品，按“2.1”项下条件进样测定，计算含量。结果见表3。

表3 不同产地雷公藤药材中雷公藤甲素和雷公藤红素的含量

3 结 论

3.1 实验条件的优化

本实验对甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲醇-乙腈(1∶1)等不同提取溶剂及水液回流、超声等提取方法，提取时间，提取次数等进行了考察，最终选择甲醇-乙腈(1∶2)作为提取溶剂，提取时间2 h。由于雷公藤饮片中所含化学成分非常复杂且雷公藤甲素和雷公藤红素的含量相对较少，因此在样品处理过程中对其进行分离、纯化和富集。在参考沈秋林等[11]对雷公藤甲素提取方法的基础上考察了中性氧化铝柱与硅胶柱对分离的影响后发现使用硅胶柱雷公藤甲素与红素的分离效率低。因此，最终选择使用中性氧化铝柱对样品进行分离与富集。在洗脱过程中，二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇(10∶1)、二氯甲烷-甲醇(9∶1)等进行洗脱，洗脱速度慢，最终使用了二氯甲烷-甲醇(7∶3)作为洗脱液，洗脱速度快。

3.2 不同产地样品含量分析

对福建等四个产地的雷公藤饮片进行了含量测定后发现，不同产地的饮片中雷公藤甲素和雷公藤红素的含量差别较大，且同一产地的饮片中雷公藤甲素和红素含量亦存在明显差异。由实验结果可知，雷公藤甲素在云南和湖北产的雷公藤饮片中含量较高，而福建、广东产的饮片含量较低。雷公藤红素则在湖北、广东产的饮片中含量较高，而在云南和福建产的饮片则含量低。在同一产地饮片中，云南产饮片中雷公藤甲素和红素含量差异最为显著。

本研究通过对雷公藤甲素和雷公藤红素两种物质进行含量测定，发现市售不同产地的雷公藤饮片的质量存在差异。然而，由于中药雷公藤所含物质复杂[12-14]且本实验所采集的雷公藤饮片的产地有限等问题，因此，需通过进一步研究来综合评价各产地雷公藤饮片的质量。