“黄金洗剂”逆转ESBLs+E.coli耐药性的体外实验研究*

2020-08-26衡雪源左志文朱德全刘江涛王立坤彭善鑫朱晓松王善超

国际检验医学杂志 2020年16期

衡雪源，左志文，朱德全，刘江涛，张磊，王立坤，彭善鑫，朱晓松，王善超

(1.山东省临沂市人民医院多重耐药菌与真菌感染控制研究所，山东临沂 276000；2.山东省临沂市人民医院肛肠科，山东临沂 276000；3.北京航空航天大学医工交叉创新研究院/北航大数据精准医疗高精尖创新中心，北京 100191)

肛肠疾病属于临床多发病，其发病率高达59%，手术治疗是常用方式，而由于肛门位置的特殊性，条件致病菌极易导致创面感染，不仅降低手术成功率，还严重影响患者术后康复效果[1]。李敏皓等[2]通过分析220例肛肠手术患者切口周围分泌物的菌群变化，发现全部患者检出的细菌包括大肠埃希菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、肠球菌、白色念珠菌等，而E.coli占比超过50%。E.coli是临床中常见的条件致病菌，可能引起尿路感染、血行感染和肠道感染等，在近10年的检测标本中，E.coli的检出数量历年均居前5位[3]。产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是一种主要由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类和单环类抗菌药物的β-内酰胺酶[4]。ESBLs对抗菌药物的选择要求较高，极易引起新的耐药株产生，随着临床抗菌药物的大量使用和不合理使用，产ESBLs的E.coli(ESBLs+E.coli)的检出率呈逐年上升的趋势，给临床抗感染诊疗带来极大的挑战[5]。因此，进行延缓或逆转细菌耐药性的相关研究具有重要意义。在肛肠疾病手术后，除了传统的抗菌药物治疗，常采用复方黄柏洗剂进行坐浴辅助治疗，其效果明显优于单纯抗菌药物治疗。本研究主要探讨复方黄柏洗剂改良方“黄金洗剂”对ESBLs+E.coli的体外抗菌效果及其逆转细菌耐药的部分机制，以期为临床中药与抗菌药物联合使用治疗感染性疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1菌株来源依据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)推荐的抗菌药物药敏试验操作方法和判断标准[6]，从2018年12月至2019年6月山东省临沂市人民医院多重耐药菌与真菌感染控制研究所分离的菌株中筛选出20株ESBLs+E.coli作为实验菌株。铜绿假单胞菌(ATCC25873)为本研究所保存的质控标准菌株，作为生物膜检测的阳性对照。

1.2试剂头孢噻肟(CTX，30 μg)、头孢曲松(CRO，30 μg)、头孢吡肟(FEP，30 μg)药敏纸片购自英国Oxoid公司；头孢噻肟(CTX)粉末购自中国药品生物制品检定所。三氯乙酸(TCA)购自北京索莱宝科技有限公司；营养琼脂购自杭州滨和微生物试剂有限公司；蛋白检测试剂盒购自天根生化科技有限公司；结晶紫染液购自法国生物梅里埃公司。

1.3方法

1.3.1中药“黄金洗剂”的制备复方黄柏洗剂应用于各类痔疮及肛门疼痛、术后的治疗等有较好的疗效[7]，山东省临沂市人民医院肛肠科在复方黄柏洗剂经典方的基础上进一步改良，得到“黄金洗剂”，效果甚佳，本研究探讨其对ESBLs+E.coli耐药性的逆转效果。“黄金洗剂”的配方如下：黄柏20 g，金银花20 g，苦参20 g，荆芥20 g，荔枝草30 g，白矾20 g，玄明粉 10 g，川椒30 g，经医院制剂室自动煎药机浓煎，最终原药材质量与煎液体积比为1.0 g/mL，瓶装备用。

1.3.2中药“黄金洗剂”最低抑菌浓度(MIC)检测采用试管稀释培养法检测MIC。接种ESBLs+E.coli 1×106cfu/mL，分别置于含不同浓度“黄金洗剂”的肉汤中培养，以无中药的肉汤培养基为对照，24、48、168 h时观察试管的浑浊程度，结果判定标准：肉汤完全清亮表示无细菌生长，记为-；肉汤浑浊表示有细菌生长，记为+。以肉眼观察无细菌生长试管中的最低药物浓度为MIC值[8]。

1.3.3药敏检测将中药“黄金洗剂”配制成低于MIC的肉汤(含药0.5 g/mL和0.1 g/mL)，以无中药肉汤为对照(中药未处理组)，接种ESBLs+E.coli 1×106cfu/mL，分别培养24、48、168 h后(中药处理组)，采用改良Kirby-Bailer法，参照CLSI推荐的方法判定结果[6]。测量并比较中药处理前后抑菌圈直径(单位：mm)。中药方剂逆转耐药菌株的逆转率计算公式：逆转率=(D2-D1)/D1×100%(D1为干预前的药敏直径，D2为干预后的药敏直径)。实验重复3次，结果取平均值。

1.3.4生物膜抑菌率的检测将菌液加入96孔板中，37 ℃培养24 h后，无菌生理盐水清洗数次后，在超净工作台上完全风干。加入结晶紫染液，室温染色，无菌双蒸水清洗数次，自然完全风干。加入33%冰醋酸，脱色10 min后于575 nm处检测吸光度(A)值。分别以新鲜培养基、ATCC25873菌液作为阴性对照组和阳性对照组，做3个平行重复实验。生物膜的抑制率(BIR)=(A0-A1)/A0×100%(A0为中药未处理组的A值，A1为中药处理组的A值)。

1.3.5细菌粗酶提取与ESBLs酶活性的检测取等量ESBLs+E.coli于无菌小管中，离心后留菌备用。磷酸盐(PBS)缓冲液重悬细菌，反复冻融8～10次，4 ℃ 8 000 r/min离心10 min，留取上清。将60 μL的0.01 mol/L PBS、60 μL的100 μg/mL CTX溶液和30 μL的粗酶提取液分别加入96孔板中，于37 ℃孵育，精确计时，加入终止液60 μL的5%三氯乙酸终止反应，于235 nm检测A值。60 μL CTX作为空白对照，做3个平行重复实验。

酶活性单位：在37 ℃，pH值为7.0时，每1 mL酶液内每1 mg活性蛋白质每1 min内水解底物的量。酶活性单位(U)=△A/0.03×T；公式中△A为37 ℃，235 nm下的AN-A0，AN为测试后数值，A0为空白值；0.03是将酶液体积换算成1 mL；T是酶与底物的反应时间。

2 结果

2.1中药“黄金洗剂”MIC的检测结果通过试管稀释培养法检测“黄金洗剂”的MIC发现，中药处理ESBLs+E.coli 24、48、168 h都能够抑制细菌的生长，“黄金洗剂”对ESBLs+E.coli具有一定的抑菌作用，其MIC为0.6 g/mL。见表1。

表1 不同浓度“黄金洗剂”对ESBLs+E.coli的抑菌效果

2.2中药“黄金洗剂”对ESBLs+E.coli耐药性的逆转效果通过检测中药处理后的细菌对抗菌药物的抑菌圈直径发现，与中药未处理组相比，经中药处理24 h的ESBLs+E.coli对FEP抑菌圈直径明显变大，而对CTX和CRO的抑菌圈直径大小变化并不大，见图1。根据测得的抑菌圈直径计算逆转率，0.5 g/mL的中药“黄金洗剂”作用于ESBLs+E.coli 24 h，能够逆转细菌对第四代头孢菌素FEP的耐药性，逆转率为(13.9±1.2)%，而对第三代头孢菌素CTX和CRO的影响不大。0.1 g/mL的中药对FEP、CTX和CRO无明显影响。见表2。

图1 中药“黄金洗剂”处理前后ESBLs+E.coli分离株对抗菌药物的耐药性变化

表2 中药“黄金洗剂”逆转ESBLs+E.coli耐药的逆转率

2.3中药“黄金洗剂”对ESBLs+E.coli生物膜形成的影响通过结晶紫染色法分析中药对细菌生物膜形成的影响发现，与中药未处理组相比，中药处理组能够明显抑制生物膜的形成，0.5 g/mL的中药处理24 h时，生物膜抑制效果最佳，生物膜抑制率可以达到63%，见图2。

2.4中药“黄金洗剂”对ESBLs酶活性的影响通过分析中药对ESBLs活性的影响发现，与中药未处理组相比，0.5 g/mL的中药处理细菌24 h能够明显抑制ESBLs的活性，差异有统计学意义(P<0.001)，酶活性单位从0.50 U降到0.35 U，见图3。另外，0.5 g/mL和0.1 g/mL的中药处理细菌48 h，也能够略微抑制ESBLs的酶活性，与中药未处理组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图2 中药“黄金洗剂”对ESBLs+E.coli生物膜形成的抑制作用

注：与中药未处理组比较，*P<0.05。

3 讨论

肛肠疾病患者的机体免疫功能减退，极易发生条件致病菌感染，尤其是E.coli的感染。同时，ESBLs+E.coli的临床分离率逐年升高，情况越来越严重，给抗感染治疗带来了极大的困难。单纯使用抗菌药物治疗E.coli感染极易产生新的耐药菌，因此，除了常规的抗菌药物治疗感染性肛肠疾病，常通过中药坐浴或者外敷进行辅助治疗。一方面，中药坐浴可以达到消肿止痛的目的；另一方面，清热燥湿或泻火解毒等功效的中草药不仅具有广谱抗菌作用，同时也具有降低细菌耐药性的功能[9-11]。

复方黄柏洗剂改良方中药“黄金洗剂”的主药是黄柏、苦参、金银花，黄柏具有清热燥湿、抑菌消炎、泻火解毒的功效，苦参可清热解毒，金银花能消肿燥湿、清热解毒，在肛肠疾病抗感染治疗中效果甚佳[9,12]。黄柏提取液对耐青霉素细菌产生的β-内酰胺酶有不同程度的抑制作用，金银花水煎剂对质粒的消除率较高[13]。

本研究发现，外用中药“黄金洗剂”能够有效抑制ESBLs+E.coli的生长，测得中药“黄金洗剂”的MIC为0.6 g/mL。同时，本研究发现，0.5 g/mL的中药“黄金洗剂”处理ESBLs+E.coli 24 h，能够有效逆转ESBLs+E.coli对FEP的耐药性。以上研究结果提示在肛肠疾病抗感染治疗中辅以中药“黄金洗剂”治疗，能够减少耐药菌的出现，提高治愈率。考虑到中药可以通过改变生物膜形成、影响酶活性等途径逆转细菌的耐药性[9]，本研究进行了进一步机制研究，结果发现0.5 g/mL中药“黄金洗剂”处理细菌24 h时对生物膜形成的抑制率能达到63%，而此时只表现出对FEP耐药性的明显改变，对CTX、CRO的效果并不明显，这可能与3种抗菌药物本身的生物膜穿透能力与穿透方式有关，需要进一步深入探讨。另外，检测中药“黄金洗剂”处理对酶活性的影响，结果发现0.5 g/mL的中药“黄金洗剂”作用细菌24 h对ESBLs活性的影响最大，可见中药“黄金洗剂”能够部分逆转细菌对FEP的耐药性，而没有逆转其对CTX、CRO的耐药性，也可能与中药对酶的影响有关，中药改变了ESBLs对第四代头孢菌素的耐药性，而没能改变对第三代头孢菌素的耐药性。在进行机制探讨的过程中，本研究发现中药“黄金洗剂”作用ESBLs+E.coli 24 h效果最好，并没有呈现“随着作用时间延长效果提高”的现象，这可能与中药有效成分被细菌消耗有关，也可能与细菌应对外界不利条件产生群体感应有关[14]，具体原因有待进一步研究。以上结果提示中药作用时间并不是越长越好，而是存在最佳的作用时间，中药在最佳作用时间才能够有效地抑制生物膜的形成和ESBLs的酶活性。

鉴于合成药物可能存在一定的不良反应，中草药在感染性疾病的治疗中发挥的作用越来越大。有研究发现，药用草本植物的水提物或者醇提物都具有抑制肠杆菌科细菌生长的功效，这为中草药在抗感染治疗中的应用提供了理论依据[15-16]。本研究发现中药“黄金洗剂”能够抑制细菌生长、逆转耐药菌的耐药性，这为抗菌药物联合中药治疗耐药菌感染提供了依据。但本研究仍有不足，需要进一步探讨分析真正起到逆转耐药作用的成分，为耐药菌的防治提供更加有利的指导。