iTRAQ联合Nano LC-MS/MS技术在早期类风湿关节炎患者血清中的差异表达蛋白质组学研究*

刘 琴，严小倩，胡红兵

(1.华中科技大学同济学院附属武汉儿童医院输血科，湖北武汉 430015；2.浙江省立同德医院检验科，浙江杭州 310012；3.浙江省立同德医院肾内科，浙江杭州 310012)

类风湿关节炎(RA)是一种慢性全身性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎为特征。早诊断、早治疗对有效预防关节破坏的进展，及时控制病情，并改善预后具有重要意义[1-3]。本研究利用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)联合纳升液相色谱-串联质谱(Nano LC-MS/MS)技术，对早期RA患者血清中的蛋白质进行鉴定和相对定量分析，并用生物信息学工具对生物学过程、细胞定位、分子功能、参与的信号通路进行富集分析。

1 资料与方法

1.1一般资料 将浙江省立同德医院2017年8月至2018年1月收治的44例早期RA患者作为病例组，男17例，女27例；平均(56.97±16.57)岁；所有患者均符合2010年欧洲抗风湿病联盟(EULAR)联合美国风湿病学会(ACR)发布的RA诊断标准；病程小于6个月，且未服用过抗风湿药物。选择同期浙江省立同德医院50例体检健康者纳入对照组；男20例，女30例；平均(51.26±13.06)岁；排除肝功能损伤、肾功能损伤、自身免疫性疾病、肿瘤、感染及传染病者，排除查体或血生化检查有异常者。本研究获得浙江省立同德医院医学伦理管理委员会批准后进行。

1.2仪器与试剂 液相色谱仪(岛津LC-20AD)、液相色谱仪(Thermo Dionex Ultimate 3000 RSLC nano，二维)、质谱仪(Thermo Scientific Q Exactive)、冷冻离心机(湘仪，H2050R)、超声仪(新芝生物，LTD JY96-ⅡN)、酶标仪(TECAN SUNRISE)。血清高丰度蛋白去除试剂盒(Sigma，批号：PROTBA-1KT)、丙酮(Thermo Fisher)、BCA 蛋白水平测定试剂盒(碧云天生物，批号：P0010S)、iTRAQ 试剂盒(ABSciex，批号：4381664);10K超滤管(Pall，批号：OD010C33)、三乙胺-碳酸缓冲液(TEAB，Sigma，批号：T418)、胰酶(Promega，批号：V5280)、甲酸(Fluka，批号：14265)、乙腈(Thermo Fisher，批号：A998-4)、甲酸铵(Sigma，批号：516961)、放射免疫沉淀法(RIPA)强裂解液(碧云天生物，批号：P0013B)、蛋白酶抑制剂(PMSF，凯基生物，批号：KGP610)。

1.3方法

1.3.1标本采集 取所有研究对象用于生化检验的血清标本100 μL，-80 ℃保存备用。

1.3.2蛋白提取 按照血清高丰度蛋白去除试剂盒说明书，去除血清中的高丰度蛋白后加入4倍体积丙酮，-20 ℃沉淀过夜。将沉淀得到的蛋白4 ℃、12 000 r/min离心20 min，去掉上清，晾干，-80 ℃保存备用。BCA法定量检测蛋白质水平。

1.3.3蛋白酶解、标记 蛋白定量检测后取200 μg蛋白溶液置于离心管中；按iTRAQ 试剂盒说明书操作，得到100 μL酶解后的样品。分别用iTRAQ试剂114、116进行标记后，混合，真空干燥。

1.3.4液相分离 将标记后的多肽混匀上样，进行第一维分析，根据峰型和时间共收取24个组分，用50%三氟乙酸(TFA)酸化，真空干燥后，进行第二维液相色谱-串联质谱分析。色谱柱流动相A：20 mmol/L甲酸胺，pH值为10。流动相B：20 mmol/L甲酸胺，80%乙腈，pH值为10。流速：200 μL/min。紫外检测波长：214 nm/280 nm。

1.3.5质谱鉴定 肽段用含2%乙腈、 0.1%甲酸样品溶解液溶解，振荡涡旋，4 ℃，13 500 r/min 离心20 min，取上清液转至上样管中，进行质谱鉴定，分离后的肽段进行在线分析，并将质谱原始数据转化成mfg文件，利用AB Sciex 的检索软件ProteinPilotTMSoftware4.5进行检索，比对鉴定。

1.3.6生物信息学分析 将各组差异表达蛋白在UniProt数据库中进行比对，并利用UniProt数据库中蛋白序列进行GO注释，对差异表达蛋白进行基于GO的细胞定位、分子功能和生物学过程进行富集分析。对差异表达蛋白进行 KEGG(http:/ /www.Kegg.jp/kegg/pathway.html)生物学通路富集分析。

2 结 果

2.1质谱鉴定分析结果 本研究共鉴定到343种蛋白，以差异倍数大于1.30或小于0.77，P<0.05为差异表达蛋白。共检测差异表达蛋白113种，包含呈上调趋势的蛋白41种和呈下调趋势的蛋白72种，差异倍数较大的20种蛋白见表1。

表1 差异倍数较大的20种呈上调或下调趋势的蛋白

2.2GO富集分析 通过GO富集分析，筛选出差异表达蛋白主要的细胞定位、分子功能及参与的生物学过程。这些差异表达蛋白主要定位在血液微粒、胞质囊泡腔、囊腔等结构，见图1。这些差异表达蛋白的分子功能主要包括肝素结合、肽酶活性调节、糖胺聚糖结合等，见图2。这些差异表达蛋白主要参与蛋白质活化级联反应、急性炎性反应、凝血调节等生物学过程，见图3。

注：1为血液微粒；2为胞质囊泡腔；3为囊腔；4为分泌颗粒腔；5为血小板α颗粒；6为脂蛋白颗粒；7为蛋白质-脂蛋白复合物；8为细胞外基质；9为内质网内腔；10为内吞小泡。

注：1为肝素结合；2为肽酶活性调节；3为糖胺聚糖结合；4为肽酶活性抑制；5为硫化合物结合；6为内肽酶活性调节；7为酶活性抑制；8为丝氨酸型内肽酶活性；9为细胞黏附分子结合；10为内肽酶活化。

2.3KEGG通路分析 将差异表达蛋白进行KEGG通路分析，发现这些蛋白主要富集于补体和凝血级联反应、金黄色葡萄球菌感染等12条 KEGG 通路，见表2。

2.4STRING蛋白-蛋白相互作用网络分析 通过STRING蛋白-蛋白相互作用网络分析发现，一些差异表达蛋白和其他差异表达蛋白间存在广泛的相互作用，即在蛋白-蛋白相互作用网络中起到关键作用，在差异表达蛋白中具有关键作用的蛋白有AHSG、FN1、ITIH3、PLG、PROS1、SERPINC1、F2、FGG、CLU、SEPP1等,在网络中与多个差异表达蛋白发生相互作用，是网络的关键节点，是研究RA机制的候选蛋白。

注：1为蛋白质活化级联反应；2为急性炎性反应；3为凝血调节；4为创伤愈合调控；5为体液免疫应答；6为蛋白质加工；7为纤溶调节；8为补体激活；9为细胞外结构排列；10为细胞与底物黏附的调节。

表2 差异表达蛋白KEGG通路分析

3 讨 论

RA是一种自身免疫性疾病，其发病机制至今尚未明确。目前，临床上诊断RA主要依靠免疫学检查及影像学资料，然而疾病的发生往往先是功能和分子标志物的变化，继而是形态学的改变。RA发病较隐匿，早期的临床表现大多不典型，容易造成误诊、漏诊，RA患者首次就诊时往往就已存在关节损伤，甚至累及多器官[1-3]。因此，寻找能反映早期RA疾病活动情况的分子标志物，在患者出现关节功能异常之前，监测RA的发展情况具有重要的临床意义。

蛋白质组学可以从细胞水平及整体水平来研究蛋白质的组成、定位、表达水平、修饰及其动态变化规律等，揭示蛋白质功能与细胞的活动规律[4-5]。iTRAQ联合质谱的定量蛋白质组学技术具有高灵敏度、标记效率高、高分辨率、样品兼容性好、重复性好等独特优势[6-7]，已广泛地应用于肿瘤[8-9]、阿尔兹海默病[10]、骨性关节炎[11-12]等多种疾病中。

本研究应用iTRAQ联合Nano LC-MS/MS技术筛选出早期RA患者与对照者之间具有明显差异的蛋白113种，利用GO富集分析了这些差异表达蛋白主要的细胞定位、分子功能及参与的生物学过程、主要信号通路，并通过KEGG通路注释进一步提取到与差异表达蛋白相关的12条KEGG通路，这些结果表明凝血纤溶系统、免疫系统、脂质代谢、细胞骨架重建与早期RA的发病机制密切相关。凝血纤溶系统异常是RA的特异性表现之一，RA患者体内存在凝血系统及抗凝系统的失衡，并由此引发其他系统相关疾病[13-14]。GO富集分析结果发现在凝血调节、纤溶调节生物学过程中有28种差异表达蛋白参与。KEGG通路分析结果发现，补体和凝血级联反应信号通路的差异最大，有15种差异表达蛋白参与这一通路，其中补体相关的差异表达蛋白也参与了金黄色葡萄球菌感染、系统性红斑狼疮等通路。由此可见，凝血纤溶系统的异常与免疫系统的异常密切相关。RA 患者多伴有血管炎性反应，这与免疫复合物沉积、纤溶系统亢进、微循环障碍有关[15-16]。临床工作中在检测炎症因子同时，也可以通过检测患者的凝血纤溶指标来监测疾病的发展情况。KEGG通路分析结果表明早期RA差异表达蛋白APOC1、APOE、APOH、LCAT与胆固醇代谢相关，这也证实了RA患者疾病的炎性反应与心血管疾病风险相关，RA疾病活动度升高有可能增加冠状动脉疾病的发生风险[17-18]。因此，可以通过检测APOC1、APOE、APOH、LCAT等与胆固醇代谢相关的指标反映疾病的相关情况，改善患者的胆固醇代谢可以缓解RA疾病的发展，预防动脉硬化的发生。

本研究通过STRING蛋白-蛋白相互作用网络分析发现，AHSG、FN1等蛋白是RA发病机制的关键节点。AHSG具有调理作用，可促进细胞内吞，与钙离子和钡离子亲和力高，是具有影响骨矿化作用的蛋白。研究表明AHSG可能在骨与软骨的发育中起重要作用[19-20]。此外，AHSG与炎症因子的调控有关。BRYLKA等[21]研究发现，AHSG减少可以引起机体炎性反应，导致软骨病变。FN1在成骨细胞的代谢中发挥着重要的作用，是成骨细胞在成骨过程中不可或缺的蛋白[12，22]。本研究发现，黏着斑、ECM-受体相互作用、癌症与蛋白多糖、肌动蛋白细胞骨架的调节等多条信号通路与RA的发生、发展均存在密切关系。因此，血清中AHSG和FN1蛋白可作为早期诊断RA的候选生物标志物。

iTRAQ联合Nano LC-MS/MS技术通过比较、分析疾病个体的差异表达蛋白，寻找疾病特异性的蛋白质，为疾病的早期诊断与预后提供可能的新型标志物，对疾病的预防、诊断、预后判断和疗效监测具有积极作用，为设计新药物的分子靶点提供实验数据。

4 结 论

本研究从差异表达蛋白质组学的角度出发，通过iTRAQ结合Nano LC-MS/MS技术成功得到了早期RA血清差异表达蛋白，并对差异表达蛋白进行生物信息学分析，为研究RA的发病机制提供了实验室数据，也为RA的诊断和治疗提供了新思路，为寻找新的监测疾病疗效的实验室指标提供了线索。