基于MALDI-TOF-MS技术建立非小细胞肺癌诊断预测模型及其初步验证*

宋御繁，周亚男，张 婷，王娜娜，陈英剑▲，胡成进△

(1.山东第一医科大学/山东省医学科学院，山东泰安 271016；2.中国人民解放军第九六〇医院实验诊断科，山东济南 250031；3.潍坊医学院医学检验学系，山东潍坊 261053)

肺癌是世界范围内癌症患者死亡的主要原因，全球每年新发肺癌患者约180万例，肺癌死亡人数占癌症死亡总人数的18.4%[1]。肺癌患者中约85%为非小细胞肺癌(NSCLC)[2]。由于早期发病隐匿，超过75%的NSCLC患者初诊时已为中晚期，丧失最佳的手术治疗时机，5年生存率低于15%[3]。为了提高NSCLC患者的长期生存率，必须对患者进行早期、正确的诊断及治疗。目前，支气管镜取组织活检是诊断肺癌的常用方法，但其为有创检查，可对患者造成一定损伤，不适用于所有患者。CT的应用在一定程度上提高了肺癌的早期诊断率，但其假阳性率高，且存在辐射的危害[4]。传统的血清肿瘤标志物作为最常用的肺癌初筛方法，灵敏度和特异度较低，缺乏足够的临床有效性，不适合用于肺癌的早期诊断。因此，临床上迫切需要更有效的检测方法辅助早期诊断NSCLC。近年来，致力于寻找肿瘤标志物的蛋白质组学研究多采用质谱技术。然而，由于血液蛋白质水平范围较大，对蛋白质组学分析提出了挑战。低丰度蛋白在疾病早期可能具有一定特异性，但由于高丰度蛋白的优势掩盖，传统质谱技术无法对其进行准确检测[5]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)作为一种新兴蛋白质组学研究技术，将质谱技术与磁珠技术相结合，利用磁珠选择性纯化血清中的低丰度蛋白，通过MALDI-TOF-MS直接分析，具有高灵敏度、高特异度、高通量的特点，为寻找NSCLC早期诊断的肿瘤标志物提供了新的发展方向和技术支持。本研究旨在应用MALDI-TOF-MS技术结合ClinProTools系统分析NSCLC患者及体检健康者血清蛋白质指纹图谱，从中筛选差异蛋白/多肽，建立诊断预测模型，并评估其临床应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2018年10月至2019年6月中国人民解放军第九六〇医院收治的具有完整临床资料的56例NSCLC患者作为病例研究对象，其中男33例，女23例；年龄25～72岁，中位年龄62岁。病例纳入标准：(1)患者经组织病理学活检初次确诊为NSCLC；(2)既往未经其他手术治疗及放化疗；(3)具有完整临床病理学诊断资料；(4)无其他恶性肿瘤病史。选择56例同期门诊体检健康者作为健康对照者，其中男37例，女19例；年龄26～75岁，中位年龄61岁。健康对照者纳入标准：(1)经体检各项检测指标均正常；(2)无肿瘤，无糖尿病、高血压等代谢性疾病，无炎症性疾病，无心、肝、肾等重要脏器疾病；(3)无手术史及输血史。按照3∶1比例将病例与健康对照者随机分为训练组(NSCLC患者42例，体检健康者42例)和验证组(NSCLC患者14例，体检健康者14例)。训练组用以建立NSCLC诊断模型；验证组用以评估模型的诊断效能。各组中NSCLC患者与体检健康者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。

表1 各组一般资料比较

1.2仪器与试剂 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(Autoflex Speed MALDI-TOF /TOF MS)购自德国Bruker Daltonics公司；2114型号磁珠分离器购自美国Life Technologies公司；低温高速离心机购自德国Eppendorf公司；弱阳离子交换磁珠(WCX-MB)试剂盒、MTP AnchorChip 384 BC靶板购自德国Bruker Daltonics公司；FlexControl、ClinProTools系统软件；蛋白/多肽标准品购自德国Bruker Daltonics公司；α-氰基-4羟基肉桂酸(HCCA)、色谱级无水乙醇(HPLC)、色谱级乙腈(CAN)、三氟乙酸(TFA)均购自美国Sigma-Aldrich公司；双蒸水购自捷世康生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1标本采集 采集所有受试者清晨空腹静脉血5 mL于真空采血管中，室温下静置30 min，3 000 r/min离心5 min。将离心后的标本取上层血清分装至0.5 mL EP管中，每管100 μL，置于-80 ℃冰箱冻存。

1.3.2磁珠提取血清蛋白/多肽 将冻存血清标本从-80 ℃冰箱取出，分别在-20 ℃和4 ℃冰箱逐步复融8 h和6 h，复融后4 ℃ 10 000 r/min 离心 3 min。以下操作步骤均于冰上进行：(1)取10 μL WCX-MB试剂和10 μL结合缓冲液(BB)于0.5 mL EP管中，加样枪上下吸打混匀；(2)向EP管中加入5 μL血清，混匀后静置5 min，避免产生气泡；(3)磁珠分离器分离磁珠1 min，弃去上清；(4)向EP管中加入100 μL洗涤缓冲液(WB)，于磁珠分离器上将两样品管交换移动10次，静置1 min，弃去上清；(5)重复步骤(4)两次；(6)加入5 μL洗脱缓冲液(EB)，充分混匀，避免产生气泡，于磁珠分离器上贴壁静置2 min，将上清液移入新EP管中；(7)向EP管中加入5 μL稳定缓冲液(SB)，混匀后进行MALDI-TOF-MS分析。

1.3.3仪器校准与质量控制 检测前使用蛋白/多肽混合标准品对仪器进行校正。随机选取30例体检健康者血清标本各5 μL混合成质量控制样品，以评估质谱仪的稳定性。将质量控制样品经磁珠提取蛋白/多肽后，每15个标本点一次靶。经质谱上样检测后将获得的质谱峰进行比较，评估质谱仪的重复稳定性。

1.3.4MALDI-TOF-MS技术检测标本 取1 μL蛋白/多肽标本点到MTP AnchorChip 384 BC靶板上，每份标本点靶3次。取1 μL现配制的6 mg/mL基质(50%CAN，2%TFA，6 mg HCCA)点于干燥后的样品点上，自然放置干燥后将靶板放入质谱仪中检测。应用FlexControl 软件采集标本质谱图，参数设置：正离子线行模式(LP)下，采用75%的激光强度，在相对分子质量范围为 (1～10 )×103内采集数据，每个样品点累计轰击100×20次。

1.4统计学处理 应用ClinProTools系统软件对质谱图进行数据分析与处理，包括基线消减、校正和归一化，选取信噪比(S/N)≥5 的峰进行分析。分别采用遗传(GA)算法、快速分类(QC)算法和监督神经网络(SNN)算法建立模型，使用验证组验证模型的准确度、特异度和灵敏度，结合三者选择最佳诊断预测模型。

2 结 果

2.1质量控制标本结果分析 试验过程中每15个标本点进行一次质量控制靶点，经质谱检测后得到7个质量控制标本血清蛋白/多肽质谱图，选取相对分子质量为(1～10)×103的7个峰，计算同批次内重复性变异系数(CV)均值为19.01%(范围为12.57%～25.81%)，仪器在整个试验过程中重复稳定性良好。

2.2血清蛋白/多肽指纹图谱分析 采用ClinProTools系统软件对NSCLC患者及体检健康者原始图谱进行分析，得到NSCLC患者与体检健康者的血清蛋白质/多肽指纹图谱，见图1。在质荷比 (m/z)为(1～10)×103时，筛选出差异有统计学意义[P<0.000 001，受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)>0.80]的多肽峰11个，具体结果见表2。除m/z为5 906.73、3 242.63、2 953.73的峰在NSCLC患者中表达上调以外，其余8个峰均表达下调。其中m/z为5 906.73与2 953.73的两个峰差异最明显，其AUC分别为0.96与0.86，NSCLC患者多肽峰m/z 5 906.73与m/z 2 953.73的峰强度明显高于健康对照者，其平均谱峰图及ROC曲线见图 2。

注：A为NSCLC患者血清蛋白/多肽指纹图谱；B为体检健康者血清蛋白/多肽指纹图谱。

表2 NSCLC患者与体检健康者差异蛋白/多肽峰

续表2 NSCLC患者与体检健康者差异蛋白/多肽峰

注：A、B分别为m/z 5 906.73与m/z 2 953.73的平均谱峰图；a、b分别为m/z 5 906.73与m/z 2 953.73的ROC曲线。

2.3NSCLC诊断预测模型建立及验证 应用ClinProTools系统软件分别基于GA、SNN、QC这3种不同算法建立诊断模型，并使用验证组验证模型诊断效能，结果见表3。经验证比较发现，GA算法模型效能最佳：选取差异最明显的2个峰m/z 5 906.73和m/z 2 953.73分别作为X、Y轴做聚类分析，结果见图3，NSCLC患者与体检健康者两组间区分明显。在GA算法模型下进行验证组验证：14例NSCLC患者中正确判断13例，错误判断1例；14例体检健康者中正确判断11例，错误判断1例，另2例未识别。得到GA模型灵敏度为92.9%，特异度为91.7%，准确度为92.3%。

表3 3种诊断预测模型的诊断效能(%)

注：A为验证组NSCLC患者血清标本聚类分析结果；B为验证组体检健康者血清标本聚类分析结果；×为训练组NSCLC患者，圆形为训练组体检健康者，▲为验证组体检健康者。

3 讨 论

近年来，蛋白质组学的不断发展为肿瘤特异性生物标志物的发现打开了新的思路。目前，质谱分析是肿瘤蛋白质组学检测的核心技术，主要包括表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)[6]、MALDI-TOF-MS等，其中SELDI-TOF-MS所使用的蛋白芯片有效表面积较小，对于低丰度蛋白富集不完全[7]，不能完整反映低丰度蛋白所含有的生物标志物信息。此外，由于自身技术可重复性较差，易受多种因素影响，对于相同疾病的研究，两个不同实验室获得的结果较难达到一致[8]。传统蛋白质组学研究工具二维凝胶电泳(2D-PAGE)技术费时费力，操作复杂，技术本身存在有限的动态覆盖范围，对低丰度蛋白分离效果不佳[9]。而基于磁珠分离技术的MALDI-TOF-MS与ClinProTools生物信息学分析相结合是近年来新开发的一种高重现性、高分辨率的新型蛋白质组学技术，其优点在于不仅可以利用多种磁珠从复杂样品中筛选生物标志物及其特异性指纹图谱，还可利用串联质谱(MS/MS)技术同时识别潜在的特异性蛋白。本研究中采用WCX-MB富集血清中的低丰度蛋白/多肽，能够排除大分子蛋白的干扰，只需5 μL血清即可快速获得患者的蛋白/多肽指纹图谱，此技术操作简便、准确度高，将高通量的样品处理系统与高效能的生物信息学分析工具相结合，使试验结果更加可靠，适用于大量标本检测。

肺癌的发生和发展是一个多步骤的过程[10]，其特征是异常基因改变和蛋白表达导致细胞表型的转化及肿瘤加速进展，这个过程涉及复杂的分子信号通路和多种细胞蛋白[11]。除肺癌的遗传学特征外，还需解决其对蛋白质生物标志物的需求，以便能够对肺癌进行准确的早期诊断，监测疾病进展[12]。LIN等[13]同样采用WCX-MB提取肺腺癌患者与体检健康者血清标本中的低丰度蛋白，通过ClinProTools系统软件建立诊断预测模型，灵敏度为94%，特异度为95%，此研究与本试验获得的峰大多不同，只有m/z 2 104.83与m/z 4 054.06的峰与本试验中m/z 2 105.66及m/z 4 055.47的峰结果相近，有待于对其进行Mascot蛋白数据库搜索验证及二级质谱鉴定。

本研究通过MALDI-TOF-MS技术与ClinProTools系统软件相结合，运用GA算法建立NSCLC诊断预测模型，具有较高的灵敏度和特异度，适合用于NSCLC高危人群的筛查及辅助诊断。筛选出的m/z 5 906.73与m/z 2 953.73差异蛋白/多肽有望成为NSCLC潜在的肿瘤标志物，但由于标本量较少，研究结果存在偏倚的可能性。此次试验中使用WCX-MB提取差异性蛋白/多肽，不能代表血清中的全部蛋白/多肽谱，可能导致试验结果不全面，在后续的试验中需结合其他多种类型的磁珠或方法对血清标本进行前处理。此外，研究中使用的标本主要来源于肺腺癌患者，且患者多为晚期，在后续研究中会进一步扩大标本量，纳入更多早期患者及肺鳞癌等其他组织学类型患者的血清标本，丰富试验内容，细化分组，进一步验证该诊断预测模型的诊断效能。对于本试验所获得的差异蛋白/多肽，后续会通过高效液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)法对其进行鉴定，以进一步研究候选血清肿瘤标志物在NSCLC发病机制中的生物学作用。

4 结 论

本试验基于高通量MALDI-TOF-MS技术联合ClinProTools系统软件建立NSCLC诊断预测模型，能够以较高的灵敏度和特异度鉴别NSCLC患者和体检健康者，具有较好的诊断效能。同时，研究发现两个具有诊断价值的差异蛋白/多肽有望成为新的NSCLC血清肿瘤标志物，为后续鉴定及体内生物学效应研究奠定了基础，具有重大临床意义。