开管毛细管电色谱分析3种解热镇痛药物

刘丽丽, 乔 娟, 张红医, 齐 莉*

(1. 中国科学院化学研究所活体分析化学院重点实验室, 北京 100190; 2. 中国科学院大学化学科学学院,北京 100049; 3. 河北大学化学与环境科学学院, 河北 保定 071002)

解热镇痛药兼有解热镇痛作用,是一类作用于中枢系统的非甾体抗炎药物,其有效成分包括4-氨基安替比林(4-AA)、氨基比林(AP)、非那西汀(PH)等[1,2],但由于其潜在的副作用,已不再单独一味药使用,因此准确监测并控制体液中的解热镇痛药含量对于疾病的有效治疗及药物的安全使用极其重要。

常用的解热镇痛类药物分离分析方法包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法及毛细管电泳法等[1-3]。近年来,基于毛细管电泳法所呈现的分离效率高、样品用量少等优点,人们常用胶束电动毛细管色谱-质谱联用法来分离分析具有结构相似且呈现中性的药物[4]。此分离模式虽然可以弥补毛细管区带电泳较难分离中性物质的不足,且能显著改善分离效率,但采用胶束电动毛细管色谱法需要在电泳运行缓冲溶液中添加大量的表面活性剂,这不仅会污染质谱离子源,也会降低被分析物的电离效率及抑制检测信号[5],进而导致毛细管电泳与质谱的联用严重受限。

开管毛细管电色谱(OT-CEC)是以管壁涂覆固定相的毛细管为分离柱,并根据被分析物与固定相之间的相互作用及其电场中有效电泳淌度的不同而进行分离[6,7]。OT-CEC是一种分离中性化合物的有效方法,通过改变毛细管表面涂覆的固定相就可改善分离效率和调控电渗流(EOF)方向[8],如壳聚糖基质材料的涂层毛细管在pH 1.8～12.0范围内会表现出两亲性质,通过改变OT-CEC缓冲液的pH值至其低于4.5,使涂层毛细管表面带正电并基此反转EOF方向[9]; Zhu等[5]合成制备了聚十一烷基硫酸钠,在毛细管内壁构建了聚十一烷基硫酸钠/聚二烯丙基二甲基氯化铵双涂层,成功实现了5种抗癫痫药物(氯硝安定、氟硝安定等)的OT-CEC分离;Xu等[10]采用开环反应将聚甲基丙烯酸缩水甘油酯键合在毛细管表面并以赖氨酸后修饰该涂层管,发现所构建的OT-CEC体系能极大提高被分析物的分离效率;Tang等[11]在毛细管表面键合了超交联聚合物,使用含20%乙腈的5.0 mmol/L硼砂-氢氧化钠(pH 9.5)作为缓冲溶液并采用OT-CEC策略,成功分离了酮洛芬类药物;Olsson等[12]将亲和素共价键合于毛细管表面,以含5%(v/v)甲醇的10.0 mmol/L乙酸铵-乙酸(pH 5.8)作为缓冲溶液,开展了治疗消化道疾病药物(如奥美拉唑等)的OT-CEC分离分析研究。综上可知,在OT-CEC体系中不需添加表面活性剂,通过调控被分析物与毛细管涂层固定相之间的相互作用就能改善药物的OT-CEC分离效率[13-17],也能调控EOF的方向。但这些已报道的工作,在聚合物涂层的合成制备中存在操作复杂、耗时,及为了获得药物的OT-CEC高效分离效率需添加有机溶剂的缺点[5,11,12]。因此,为解决上述难题,不仅需要发展两亲性嵌段聚合物的简单制备方法,还需要进一步以其作为毛细管涂层来开展解热镇痛药物的绿色OT-CEC分离分析研究。

在本工作中,采用活性/可控自由基可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合方法,合成制备得到了两亲性嵌段聚合物,聚(苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯)(P(St-GMA)),将其涂覆到毛细管内壁,采用乙酸钠-乙酸作为电泳运行缓冲液(不需添加任何有机溶剂和表面活性剂),构建了解热镇痛药物的OT-CEC分离分析新体系,还探讨了嵌段聚合物的聚合时间、涂层聚合物浓度及缓冲液pH等因素对P(St-GMA)自组装行为及对解热镇痛药物OT-CEC分离度(Rs)及迁移时间的影响,成功实现了血样中3种解热镇痛药物的快速高效分离,为设计制备更多功能性嵌段聚合物及其在药物OT-CEC中的绿色分析应用研究提供了新思路和新启示。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

CL1020毛细管电泳分析仪、254 nm紫外检测器(华阳利民有限公司,中国);石英玻璃毛细管(75 μm (i.d.)×60.0 cm(总长)×50.0 cm(有效长))(河北永年锐沣色谱器件有限公司,中国); HW-2000色谱工作站(南京千谱软件有限公司,中国); Milli-Q纯水仪(Millipore公司,美国)。

4-AA(疏水常数logP=0.81)、AP(logP=0.99)购自Acros公司(美国); PH(logP=1.58)购自上海梯希爱化成工业发展有限公司;GMA、偶氮二异丁腈(AIBN)、St和二硫代苯甲酸苄酯(BDTB)购自Sigma-Aldrich公司(美国);N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、硫脲、乙酸钠(NaAc)、乙酸铵(NH4Ac)、乙酸(HAc)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮及其他试剂均为分析纯。SD大鼠血清样品由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 嵌段聚合物涂层管的制备

采用RAFT聚合法,以St及GMA为单体、AIBN为引发剂、BDTB为链转移剂合成了嵌段聚合物P(St-GMA),具体操作步骤如文献[14,15]所述。通过凝胶渗透色谱(GPC)分析,获知P(St-GMA)的相对分子质量为18.8 kDa。

裸毛细管分别用1.0 mol/L NaOH溶液、纯水及甲醇各清洗10 min后,3 h内将1.0 mL含50.0 mg/mL P(St-GMA)的DMF溶液慢速流经毛细管,聚合物涂层管于25 ℃干燥12 h后,再放入50 ℃烘箱中烘干2 d,备用。

1.3 样品前处理

用缓冲液配制3种药物(0.2 mg/L)的储备液,于4 ℃冰箱保存,备用。取60.0 μL鼠血清样品与200.0 μL乙腈混合,于25 ℃离心20 min(12 000 r/min)[18];取上清液,用N2吹干,于-18 ℃冰箱中冷藏保存,备用。以2.0 mg/mL硫脲作为考察EOF的标记物。

1.4 分析条件

进样前,涂层毛细管用纯水及缓冲溶液各冲洗10 min,样品通过高差方式进样(15.0 cm, 8 s)。OT-CEC分离电压为+15.0 kV,电泳缓冲液为50.0 mmol/L NaAc-HAc (pH 5.7), 0.45 μm滤膜过滤,备用。Rs1为AP与4-AA之间的分离度;Rs2为4-AA与PH之间的分离度。

图 1 (a)P(St-GMA)的FT-IR图谱和(b)裸毛细管及(c、d)涂层毛细管的SEM图Fig. 1 (a) FT-IR of P(St-GMA) and SEM images of (b) bare capillary and (c, d) coated capillaryP(St-GMA): poly(styrene-co-glycidyl methacrylate); SEM: scanning electronic microscopy.

2 结果与讨论

2.1 嵌段聚合物涂层管的制备及表征

P(St-GMA)的傅里叶变换红外光谱(见图1a)展示了苯环上有-CH2-振动吸收特征峰(2 922 cm-1)、C=O振动吸收特征峰(1 600 cm-1和1 732 cm-1)、C=C双键特征吸收峰(1 450 cm-1和1 492 cm-1)及C-H的面外弯曲振动吸收峰(698 cm-1)[14],表明嵌段聚合物合成成功。从扫描电子显微镜(SEM)图中可观察到在毛细管内壁形成了明显与裸毛细管(见图1b)不同的涂层表面(见图1c和图1d),表明涂层毛细管已成功制备。

裸毛细管的EOF值为5.6×10-4cm2/(V·s),嵌段聚合物涂层管的EOF值为4.0×10-4cm2/(V·s)。结果表明:涂层管可有效抑制EOF,并会影响被分析物的OT-CEC分离度及其迁移时间。连续进样10次测定EOF值,其相对标准偏差(RSD)<2.0%,表明该涂层管具有良好的稳定性。

图 2 (a)聚合时间、(b)聚合物含量、(c)缓冲溶液种类、(d)有机溶剂添加剂、(e)缓冲液pH值、(f)NaAc浓度对药物OT-CEC分离度的影响和(g)缓冲液pH和(h)NaAc浓度对涂层管EOF的影响(n=3)Fig. 2 Effect of (a) polymerization time, (b) contents of P(St-GMA), (c) buffer types, (d) organic solvent additives,(e) pH values of buffer, (f) concentrations of NaAc on the resolutions (Rs) and (g) pH values of buffer and (h) concentrations of NaAc on the electroosmotic flow (EOF) of coated capillary (n=3) Rs1: resolution between antipyrine (AP) and 4-aminoantipyrine (4-AA); Rs2: resolution between 4-AA and phenacetin (PH); Buffer 1: K2HPO4-NaH2PO4; Buffer 2: NH4Ac-HAc; Buffer 3: NaAc-HAc; ACN: acetonitrile; MeOH: methanol; DMK: acetone; EtOH: ethanol.

2.2 OT-CEC分离条件优化

实验首先考察了不同聚合时间所制备的P(St-GMA)对3种解热镇痛药物Rs的影响。如图2a显示,使用聚合时间为3 h的涂层管时,这3种解热镇痛药物的迁移时间<10 min,但4-AA与AP不能基线分离(Rs1<1.5),而增加聚合时间可显著提升药物的OT-CEC分离度(Rs1>1.5、Rs2>1.5),但当聚合时间从3 h增加至24 h时,这3种解热镇痛药物的OT-CEC迁移时间也随之延长至23 min。随着P(St-GMA)含量从30.0 mg/mL升高至70.0 mg/mL,被分析物与聚合物涂层之间的相互作用亦随之增强,并显著改善了这3种解热镇痛药物的OT-CEC分离度(见图2b),但被分析物的迁移时间亦从<10 min延长至40 min。综合考虑,能在最短的迁移时间内达到最佳分离的目的,最终选择12 h为最佳聚合时间,并以50.0 mg/mL聚合物涂覆的毛细管来开展后续的OT-CEC分离分析研究。

其次,实验考察了3种不同的缓冲液对解热镇痛药物分离度的影响(见图2c)。结果发现:以K2HPO4-NaH2PO4作为OT-CEC的缓冲溶液时,4-AA与PH不能基线分离(Rs2<1.5);采用NH4Ac-HAc和NaAc-HAc作为缓冲溶液时,虽然可实现被测药物的基线分离(Rs1>1.5、Rs2>1.5),但以NH4Ac-HAc为缓冲溶液时,这3种药物的迁移时间(20 min)要长于以NaAc-HAc为缓冲溶液的分析体系(12 min)。依据有机溶剂极性的不同,进一步考察了4种常用有机溶剂[17]对被测药物OT-CEC分离度及迁移时间的影响。如图2d所示,当在NaAc-HAc缓冲液中添加15.0%(v/v)丙酮时,4-AA与PH完全不能分离;而以添加了15.0%(v/v)乙腈、15.0%(v/v)甲醇及15.0%(v/v)乙醇的NaAc-HAc作为缓冲溶液,均能实现这3种药物的基线分离(Rs1>1.5、Rs2>1.5),但它们的迁移时间却从不含有机溶剂体系的12 min大幅延长至25 min。结果表明:乙腈、甲醇及乙醇这3种有机溶剂添加剂有利于嵌段聚合物在溶液中形成胶束结构[17],并能显著增加被分析物的分离度,但会导致其迁移时间大幅延长。为实现高效、快速及绿色分离,最终以不添加任何有机溶剂的NaAc-HAc为缓冲溶液来开展解热镇痛药物的OT-CEC分离分析研究。

据文献报道[10,12],缓冲液pH对毛细管内壁的电荷分布及被分析物的分离效率有显著影响。由于解热镇痛药物的pKa值接近5.0[19],因此实验考察了不同缓冲液pH值(5.5～6.8)对解热镇痛药物分离度及迁移时间的影响[12,19]。如图2e显示,在缓冲液pH为5.5～6.0时,3种被分析物均可实现OT-CEC基线分离(Rs1>1.5、Rs2>1.5),而pH为5.7时,药物的迁移时间最短,这要归功于药物在低pH缓冲液中的部分解离及其与聚合物胶束的相互作用;而当缓冲液pH值增加至6.8时,被分析物的迁移时间略微减小(<10 min),但只能部分分离AP与4-AA(Rs1<1.5),且完全不能分离4-AA与PH(Rs2=0)。实验进一步考察了缓冲液中NaAc的浓度(10.0～70.0 mmol/L)对药物分离度的影响(见图2f)。结果发现:当NaAc浓度从10.0 mmol/L增至30.0 mmol/L时,被分析物的Rs明显增加;当其浓度从30.0 mmol/L继续增至70.0 mmol/L时,药物的迁移时间从14 min大幅缩短至<10 min,而4-AA与PH的分离度在50.0 mmol/L NaAc缓冲液中达到最大值(Rs2=2.3)。基此,为在最短的迁移时间内获得最佳Rs值,最终选择了50.0 mmol/L NaAc-HAc(pH 5.7)进行后续OT-CEC研究。

图 3 3种药物的(a)裸管毛细管区带电泳图、(b)裸管胶束电动毛细管色谱图和(c)OT-CEC谱图Fig. 3 (a) Bare tube capillary zone electrophoresis, (b) bare tube micelle electrokinetic capillary chromatogram and (c) OT-CEC electropherogram of the three drugs1. AP (100.0 μmol/L); 2. 4-AA (100.0 μmol/L); 3. PH (80.0 μmol/L).

如图2g及图2h显示,缓冲液pH(5.5～6.8)及NaAc浓度(10.0～70.0 mmol/L)的改变仅对涂层管的EOF值产生微小的影响,表明该涂层管具有良好的EOF抑制效果,因此,被分析物的OT-CEC分离度及其迁移时间主要取决于其与涂层管表面的嵌段聚合物的相互作用力(包括亲疏水作用及氢键作用)。

2.3 OT-CEC分离机理

如图3a显示,使用裸毛细管以毛细管区带电泳分离模式不能实现这3种药物的良好分离;在缓冲液中添加了50.0 mmol/L表面活性剂SDBS,以裸管胶束电动毛细管色谱分离模式可实现被分析物的基线分离(见图3b);而在缓冲液中不添加SDBS及有机溶剂添加剂,采用OT-CEC分离模式,可基线分离这3种被分析物(Rs1=3.8、Rs2=2.3)(见图3c)。值得一提的是,这3种解热镇痛药物的OT-CEC迁移顺序与胶束电动毛细管色谱的迁移顺序相反。与毛细管区带电泳分离模式(见图3a)及胶束电动毛细管色谱分离模式相比(见图3b),虽然被分析物PH出现了峰拖尾现象(见图3c),但其OT-CEC迁移顺序却与药物的疏水特性(logPAP=0.99、logP4-AA=0.81、logPPH=1.58)基本吻合,基此推测:PH同嵌段聚合物涂层之间的较强疏水相互作用[20]是导致此峰展宽的主因。

基于上述实验结果及药物的迁移顺序推测,涂层管中的嵌段聚合物可以起到“类表面活性剂”的作用[17],其OT-CEC的分离机理见图4。P(St-GMA)具有两亲性,其中的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)嵌段部分具有亲水性,而聚苯乙烯(PSt)嵌段部分具有强烈的疏水性。在水溶液中,P(St-GMA)易于发生自组装并形成类表面活性剂胶团结构。在电场力作用下,由于被分析物的有效电泳淌度不同,其与聚合物类表面活性剂胶团的相互作用(包括亲疏水作用及氢键作用)强弱不同,使得各自的迁移时间不同,最终实现这3种解热镇痛药物的高效分离。

2.4 方法学验证

以解热镇痛药物的峰面积为纵轴(y, μV·s),以其浓度为横轴(x, μmol/L)绘制标准曲线,其线性相关系数(R2)≥0.995(见表1)。方法的检出限(LOD)通过3倍信噪比(S/N=3)来确定。被分析物在涂层管的日内、日间和柱间的迁移时间及峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.27%～3.46%(n=3)。结果表明:该聚合物涂层管具有良好的稳定性与重复性,所发展的OT-CEC分析方法可用于解热镇痛药物的定量分析。

图 4 基于P(St-GMA)涂层与药物相互作用的OT-CEC分离机理示意图Fig. 4 Mechanism illustration for OT-CEC analysis based on the interaction between P(St-GMA) coating and the drugs

表 1 3种药物的线性方程、相关系数、线性范围和检出限

进一步将所构建的OT-CEC方法用于鼠血清空白样品(见图5a)及添加了药物的血清样品的分离分析(见图5b)。血清样品在添加解热镇痛药物后回收率为97.0%～104.1%(见表2)。结果表明:所建OT-CEC分析方法可用于实际血清样品中解热镇痛药物的定量分析。

图 5 (a)血清空白样品和(b)加标血清样品的OT-CEC谱图Fig. 5 OT-CEC electropherograms of (a) the blank serum and spiked serum sample 1. AP (100.0 μmol/L); 2. 4-AA (100.0 μmol/L); 3. PH (80.0 μmol/L).

表 2 血清样品中3种药物的回收率(n=3)

3 结论

以所设计及合成制备的两亲性嵌段聚合物P(St-GMA)为毛细管涂层,以NaAc-HAc为缓冲液,构建了新型OT-CEC分析体系,实现了3种解热镇痛药物的基线分离。嵌段聚合物P(St-GMA)在溶液中发生自组装形成类表面活性剂胶团结构,显著提高了解热镇痛药物的分离度,还避免了使用有机溶剂所造成的环境污染。所建立的OT-CEC方法展现了其可通过调控被分析物与嵌段聚合物涂层之间的相互作用来实现高效分离的特点,这将有助于OT-CEC在实际血样中药物的分析应用。