毛细管电泳法测定天麻素对乙酰胆碱酯酶活性的抑制

张 剑, 张 博, 贺茂芳, 韩 禄, 高东羽, 刘春叶

(西安医学院药学院, 陕西 西安 710021)

乙酰胆碱酯酶(AChE)是生物神经传导中的一种关键性酶。在胆碱能突触间,该酶能降解乙酰胆碱,终止神经递质对突触后膜的兴奋作用,保证神经信号在生物体内的正常传递[1]。

阿尔茨海默症是引起中老年人痴呆最常见的疾病,AChE抑制剂(AChEI)是当前治疗该疾病的主要药物[2]。AChEI的药理作用是抑制AChE的活性,从而维持神经系统中乙酰胆碱的正常水平。因此,AChEI的筛选研究受到了广泛关注[3-7]。目前,其筛选方法有比色法[8]、薄层色谱法(TLC)[9]、高效液相色谱法(HPLC)[10]、质谱法(MS)[11]、荧光法[12]等等。由于毛细管电泳(CE)具有分离模式多、分离效率高、样品消耗少等优点,近年来被广泛应用于酶学研究及抑制剂筛选等相关领域[13-18]。分段注入酶和底物溶液的毛细管电泳介导酶微反应器技术操作简单,实现了反应和检测的一体化,但每次运行需更换新的酶溶液塞[15-16,18]。开管毛细管固定化酶微反应器可重复使用、易调控,近年来受到广泛关注。靶标酶的固定化可通过共价键[13,14]和离子键[17]来实现,共价键法所得酶反应器稳定性好,但制备过程耗时较长,与之相比离子键合法则操作简单快速。

建立快速地从天然产物中筛选AChEI的方法,将对临床治疗阿尔兹海默症有积极的作用。天麻在临床上被广泛应用于阿尔兹海默症、帕金森、中风、眩晕等脑部神经损伤性疾病的治疗。作为天麻的重要药效成分之一,天麻素能够抑制AChE的活性,增加脑内乙酰胆碱的含量。本文以海美溴铵(HBD)修饰一段毛细管内壁,使其带正电荷,再通过离子键键合AChE制备固定化微量酶反应器,采用CE法测定天麻素对AChE活性的抑制能力,从而评价CE在筛选AChEI上的优势。与文献[17]相比,该方法对毛细管采用区域处理,过程更简单、快捷。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与药品

P/ACE MDQ毛细管电泳仪(美国贝克曼库尔特有限公司); AX224ZH电子精密天平(奥豪斯仪器常州有限公司);KQ5200DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); PB-10 pH酸度计(德国塞多利斯科学仪器有限公司); UV-160A紫外可见分光光度计(上海精密仪器厂)等。

乙酰胆碱酯酶(220 u/g)、碘化乙酰硫代胆碱(AThC,≥98.0%,分析纯)和5′5-二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)(≥99.0%,分析纯)均购自索莱宝生物科技有限公司。天麻素(≥98.0%,分析纯,上海安谱实验科技股份有限公司);海美溴铵(≥94.0%,分析纯,西格玛试剂有限公司);聚二烯二甲基氯化铵溶液(≥20%,分析纯,阿拉丁试剂有限公司,);磷酸氢二钠、磷酸二氢钠(≥98.0%,分析纯,西安化学试剂厂);N,N-二甲基甲酰胺(≥99.5%,分析纯,天津市恒兴化学试剂制造有限公司);十二烷基硫酸钠(SDS)(分析纯,阿拉丁试剂有限公司);氢氧化钠(分析纯,天津市河东区红岩试剂厂);浓盐酸(≥36.0%,分析纯,四川西陇科学有限公司);实验用水均为去离子水(陕西娃哈哈乳品有限公司)等。

1.2 溶液配制

精密称取乙酰胆碱酯酶0.050 0 g,用Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5,浓度20 mmol/L)溶解,得11 u/mL的AChE溶液,分装于离心管中。精密称取AThC 0.005 7 g,用去离子水2 mL溶解于离心管中,得10 mmol/L的AThC溶液。精密称取HBD0.050 0 g,用去离子水溶解并定容于50 mL容量瓶中,得约0.1%(质量分数)的HBD溶液。

精密称取天麻素0.0020 g，用去离子水2 mL溶解于离心管中，配制成1 g/L的天麻素溶液。用去离子水稀释此天麻素母液，得到0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/L (即0、0.87、1.75、2.62、3.50、4.37和5.24 μmol/L)的天麻素溶液。

精密称取磷酸氢二钠0.7196 g、磷酸二氢钠0.3127 g,分别加去离子水溶解,定容于100 mL容量瓶中,配成pH 8.0, 20 mmol/L 的磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲液)。

1.3 毛细管内壁改性

取70 cm的新毛细管柱(内径75 μm),分别用1 mol/L NaOH溶液、去离子水、1 mol/L HCl溶液、去离子水冲洗30、5、20、5 min。N2吹干。在0.015 MPa的压力下,通入HBD溶液10 s,停留5 min,再用去离子水冲洗5 min,在毛细管内壁吸附上一段正电荷涂层[13]。

1.4 固定化AChE微反应器的制备

在0.015 MPa的压力下向柱中注入AChE溶液10 s,柱中留置5 min,酶通过与HBD之间的静电引力固定在毛细管柱内壁上,得到一段1.5 cm长的酶溶液塞。用PBS缓冲液冲洗3 min,洗掉未固定的酶溶液,即得固定化AChE微反应器。在离线状态下,采用相同压力向毛细管中压入酶溶液,用直尺测量得到酶溶液塞的长度。

1.5 AChE微反应器的活性考察

在不存在(或存在)抑制剂天麻素的条件下,将底物AThC(0.1 mmol/L)注入酶反应器中(0.015 MPa×10 s);停留1 min后,将产物与未反应的底物进行电泳分离。在两次运行之间,将毛细管和电极浸入水中清洁电极和毛细管的入口端,以防止酶和底物溶液相互污染。电泳条件为:毛细管总长度60.2 cm(有效柱长50 cm,内径75 μm),柱温25 ℃,检测波长214 nm, PBS缓冲体系(pH 8.0, 20 mmol/L),电压-15 kV。通过测量产物的电泳峰面积来测定天麻素对AChE活性的抑制情况。

1.6 AChE微反应器的再生

当固定化酶微反应器的活性变差后,可以将毛细管柱用1 mol/L NaCl、0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH依次冲洗,以洗脱掉固定在柱上的AChE,然后重复酶的固定化制备方案。

2 结果与讨论

2.1 毛细管内壁改性方案分析

熔融石英毛细管的内表面由于硅烷醇基团的电离而带有负电荷,AChE也带有负电荷。因此,必须通过具有强阳离子基团的水溶性电解质或聚合物来改性毛细管壁内壁,使其附着上正电荷,以制备固定化酶微反应器(见图1)。本研究采用0.1% HBD溶液进行内壁改性。

图 1 毛细管柱酶反应器制备原理图Fig. 1 Schematic of the micro-enzyme reactor development in capillary columnAChE: acetylcholinesterase.

实验结果表明,HBD改性得到的正电荷涂层足够稳定,可以承受运行缓冲液的多次冲洗。此外,带正电荷的涂层可以产生恒定的反向电渗流,可加速带负电荷分析物的迁移速度,实现更为快速的分离;涂层前后中性标记物N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的出峰时间由5 min延长至10 min,可知毛细管内壁正电荷改性成功。

2.2 实验条件的优化

2.2.1底物进样时间的考察

采用压力进样法(0.015 MPa)将底物注入酶反应器,结果显示,底物(10 mmol/L AThC )注入酶反应器的时间不同会对产物的峰面积产生影响。由图2a可知,当进样时间从5 s延长到10 s时,反应产物的峰面积逐渐增加,并在10 s时达到最大,因此选择10 s作为底物的进样时间。

图 2 (a)底物进样时间和(b)反应时间对产物峰面积的影响(n=5)Fig. 2 Effect of (a) substrate injection time and (b) reaction time on peak areas of products (n=5)

2.2.2底物与酶反应器作用时间的考察

固定底物进样时间为10 s(0.015 MPa),考察底物与酶的反应时间对产物峰面积的影响。结果显示,反应时间从0.5 min延长到3.0 min,产物的峰面积逐渐增加,并在1.0 min后达到最大;当反应时间大于1.0 min后,产物的峰面积呈下降趋势(见图2b)。故选择1.0 min作为底物和酶的反应时长。

2.3 固定化酶微反应器的稳定性考察

在上述微酶反应器中,将不同浓度的天麻素重复进样10次,计算产物峰面积的相对标准偏差(RSD)值。结果显示,当天麻素质量浓度为0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/L时,产物峰面积的RSD分别为3.7%、4.0%、4.0%、5.3%、3.8%、3.6%和3.3%(n=10)。由结果可知,此固定化酶微反应器有较好的重复性。每进行100次试验,检测同一样品,峰面积基本保持一致。由此可知,该酶微反应器具有良好的活性,可持续运行至少300次。

图 3 (a)不同浓度天麻素对产物峰面积的影响及(b)抑制率拟合曲线(n=10)Fig. 3 (a) Effect of gastrodin concentration on peak areas of products and (b) the fitting curve of gastrodin inhibition rate (n=10) Concentration of gastrodin was 0, 0.87, 1.75, 2.62, 3.50, 4.37 and 5.24 μmol/L in the direction of arrow.

2.4 CE法测定天麻素对AChE活性抑制

在2 mL底物中分别添加0、0.87、1.75、2.62、3.50、4.37和5.24 μmol/L的天麻素10 μL,通过产物峰面积考察不同浓度的天麻素对AChE活性的抑制。结果表明:每次分离可在6 min内完成,随着天麻素浓度的增加,产物峰面积逐渐减小,对AChE的活性抑制越大(见图3a),即对AChE活性的抑制率逐渐增加,当天麻素浓度达到5.24 μmol/L时,抑制率达到64.8%。抑制率根据公式(1)[14,19]进行计算。

(1)

2.5 紫外分光光度法测定天麻素对AChE的活性抑制

采用传统紫外分光光度法,测定天麻素对AChE的IC50值:将2.65 mL PBS、50 μL AChE、100 μL DTNB和100 μL天麻素溶液混合,5 min后加入100 μL底物,10 min后加入1 mL 0.4% SDS终止反应,所得溶液在412 nm下测量吸光度并根据公式(2)计算抑制率[20],

(2)

3 结论

本研究基于离子吸附作用制备了固定化毛细管AChE微酶反应器,得到该固定化微酶反应器最适宜的工作条件为:底物的最优进样时间10 s,酶与底物的最优反应时间1 min。结合CE法在线研究了固定化AChE微酶反应器的性能,成功测定出天麻素对AChE的IC50值为(2.26±0.14) μmol/L。与紫外分光光度法相比较,CE法简单、高效、成本低,由仪器自动完成的固定化AChE酶反应器制备过程简单快速,稳定性较好,可重复使用,极大地提高了工作效率,未来有望应用于各类AChEI的高通量筛选,对阿尔兹海默症的治疗将产生积极的影响。