聚(2-甲基-2-唑啉)在毛细管电泳分离蛋白质中的应用
2020-08-26王雨晨王延梅
王雨晨, 王延梅
(中国科学技术大学高分子科学与工程系, 安徽 合肥 230026)
毛细管电泳(CE)是以高压直流电场为驱动力、毛细管作为分离通道,根据毛细管内样品的淌度以及分配行为等进行分离的一项液相分离技术[1]。毛细管分离技术使得分析科学从μL水平上升至nL水平,并且具有分析速度快、分离效率高、样品消耗量少、经济环保等特点,在药物研究、医学临床诊断、环境监控分析和食品分析等多个领域有着广泛的应用。然而在蛋白质分离分析领域,常用的熔融硅毛细管容易吸附蛋白质,导致电渗流不稳定,使得分离结果重现性变差[2];此外,商用CE中常用的紫外检测器(UV)光程短,使得CE-UV的检测灵敏度往往不能达到低丰度蛋白质的直接分析要求[3,4]。因此寻找能够阻止蛋白质吸附、同时能够提高CE-UV检测灵敏度的涂层是毛细管电泳分离分析蛋白质的重要课题之一。
图 1 几种常用的引发剂、终止剂和2-唑啉单体的结构式Fig. 1 Structural formulas of several initiators, termin-ators and 2-oxazoline in common use
本文将结合近年来本课题组以及国内外其他研究者的相关研究工作,对PMOXA在毛细管电泳分离蛋白质中的应用进行总结和评述。
1 聚(2-甲基-2-唑啉)的抗蛋白质吸附作用
在用CE分离分析蛋白质之前,采用聚合物修饰毛细管内壁是解决熔融硅毛细管内壁吸附蛋白质的常用方法之一。聚合物涂层通常可根据与毛细管内壁键合方式的不同分为共价键涂层和非共价键涂层。共价键涂层是指聚合物主要通过共价键键合在毛细管内壁形成的涂层。共价键涂层寿命长，稳定性好，分离效率高。但是由于涂层的制备通常需要单体在毛细管内聚合,制备工艺复杂,聚合反应难以控制,容易造成涂层的不均一性,最终使检测结果重现性变差[20]。非共价键涂层是指聚合物以非共价键键合在毛细管内壁形成的涂层,通常将组成和结构已知的聚合物配成溶液,充入毛细管,聚合物通过与毛细管内壁之间的氢键、静电引力、疏水基团间的相互作用等在毛细管内壁形成涂层。非共价键涂层毛细管制备过程简单,涂覆过程可一步完成,但由于非共价键作用力较弱,在分离过程中涂层易被缓冲溶液冲出毛细管,造成涂层不稳定。
受贻贝类海洋生物足丝分泌的黏液在潮湿的环境下依然具有超强黏附性的启发,Lee等[21]在pH 8.5的缓冲液和氧气存在的条件下,以多巴胺(DA)为单体,在不同基质(如贵金属、金属氧化物、二氧化硅、有机高分子等)的材料上制备出具有强黏附性的聚多巴胺(PDA)涂层[22-24],该涂层在一个很宽的pH值范围内(pH=1.0～12.0)均保持良好的稳定性,并且可以进一步与带有功能团(如-NH2、-SH等)的聚合物进行席夫碱或迈克尔加成反应[25-27]。
Xiang等[28]首先在不同材料(如玻璃、金片等)表面修饰PDA涂层,然后将末端带有氨基的聚(2-甲基-2-唑啉)(PMOXA-NH2)通过PDA接枝在材料表面,即通过两步法制备聚多巴胺接枝聚(2-甲基-2-唑啉)(PDA-g-PMOXA)涂层(见图2)。表面等离子共振(SPR)结果表明,溶菌酶在PDA-g-PMOXA修饰的芯片表面的吸附量是79.39 ng/cm2,而在聚多巴胺接枝聚乙二醇单甲醚(PDA-g-mPEG)修饰的芯片表面的吸附量是101.20 ng/cm2,说明PDA-g-PMOXA涂层的抗蛋白质吸附性能更好。水接触角的测试结果表明,PDA-g-PMOXA涂层比PDA-g-mPEG涂层更稳定。CE实验结果表明,PDA-g-PMOXA涂层毛细管在10 min内能有效地分离出溶菌酶、细胞色素C、核糖核酸酶A、α-胰凝乳蛋白酶原A、胰蛋白酶抑制剂、肌球素这6种酸、碱、中性蛋白质混合物,迁移时间的相对标准偏差(RSD)均小于0.05%,理论塔板数(N)大于8.0×104/m,并且能将鸡蛋清中的酸性蛋白质和碱性蛋白质有效分离。
为了进一步提高PMOXA涂层毛细管阻抗蛋白质吸附的性能,Zhang等[29]通过DA辅助共沉积法(一步法)来提高PMOXA在毛细管内壁的接枝密度。他们将部分水解的聚(2-甲基-2-唑啉)(PMOXA-EI)与DA混合,通过DA的氧化聚合以及PMOXA-EI主链中的亚氨基和PDA之间的迈克尔加成反应,分别制备了聚(2-甲基-2-唑啉-乙烯亚胺)的一次(PDA/PMOXA-EI)及二次(PDA/PMOXA-EI+PMOXA-EI)涂层毛细管(见图2)。这种涂层毛细管对4种碱性蛋白质的混合物(溶菌酶、细胞色素C、核糖核酸酶A和α-胰凝乳蛋白酶原A)可进行有效分离,N值最高可达5.4×105/m,迁移时间的RSD值均小于0.17%。在低pH值时(pH 2.53), PDA/PMOXA-EI+PMOXA-EI聚合物链上的仲胺会发生质子化,使涂层管带正电荷,可以与同样质子化的三聚氰胺(MEL)间发生静电排斥作用,阻止MEL在毛细管内壁的吸附,因此该涂层毛细管可用于奶粉中MEL的检测。研究表明,在最佳实验条件下,MEL的检出限为0.097 μg/mL,奶粉中可以检测到MEL的最低量为4 mg/kg, MEL的加标回收率为92.13%～102.47%,相对标准偏差为2.07%～4.98%,并且涂层在45 d内仍保持良好的稳定性。该方法使得实际奶粉样品中MEL的检测更加经济有效。
图 2 以PDA为黏合层制备不同类型PMOXA涂层的示意图Fig. 2 Diagram of preparing different types of PMOXA coatings using PDA as the anchor PDA: polydopamine; PMOXA: poly(2-methyl-2-oxazoline); PDA-g-PMOXA: polydopamine-graft-poly (2-methyl-2-oxazoline); PMOXA-EI: poly (2-methyl-2-oxazoline-co-ethyleneimine); PEI-g-PMOXA: poly(ethyleneimine)-graft-poly (2-methyl-2-oxazoline).
为了进一步提高PMOXA在毛细管内壁的覆盖率,增强涂层的抗蛋白质吸附能力,Du等[30]根据之前多臂星形超支化聚乙烯亚胺接枝聚(2-甲基-2-唑啉)(PEI-g-PMOXA)的研究结果[31],以超支化分子聚乙烯亚胺(PEI)作为支架,合成了一系列结构明确、具有不同PMOXA接枝率和链长(分子量)的多臂星形超支化PEI-g-PMOXA,并采用DA辅助共沉积法(一步法)[32],快速将PEI-g-PMOXA固定在毛细管内壁(见图2)。该涂层毛细管分离4种碱性蛋白质混合物(溶菌酶、细胞色素C、核糖核酸酶A和α-胰凝乳蛋白酶原A)时,所得峰的N值可达105量级;同一根PEI-g-PMOXA涂层毛细管连续分离30次后,4种蛋白质迁移时间的RSD均小于0.7%。基于PEI-g-PMOXA涂层管良好的稳定性和优异的抗蛋白质吸附性能,将其用于前沿分析毛细管电泳法(FACE)测定小分子阳离子药物对乙酰氨基酚(APAP)与牛血清白蛋白(BSA)之间相互作用的参数。结果表明,连续3次分析的结合常数(Ka)和结合位点数(n)的RSD值分别为5.1%和1.4%,连续3 d的Ka和n的RSD值分别为9.0%和2.4%,所得结果与荧光光谱法以及其他文献[33]中报道的结果相近,说明该方法具有较好的重复性和准确性。
除了以PDA为黏合层的方法外,Bai等[34]通过加热的方法,在硅、玻璃等表面制得了PMOXA涂层。他们首先以甲基丙烯酸(MAA)为终止剂,终止MOXA的阳离子开环聚合反应,得到聚(2-甲基-2-唑啉)大分子单体(PMOXA-MA)。然后通过自由基共聚,合成了梳状的聚(2-甲基-2-唑啉)-r-甲基丙烯酸缩水甘油酯(PMOXA-r-GMA)无规共聚物。Mao等[35]利用该梳状共聚物中GMA组分中的环氧基团在加热条件下可以与毛细管内壁的硅羟基发生化学反应这一特性,通过热致固化的方法制备出PMOXA-r-GMA涂层毛细管。该涂层毛细管成功地分离了4种碱性蛋白质的混合物(溶菌酶、细胞色素C、核糖核酸酶A和α-胰凝乳蛋白酶原A),N值可达8.3×105/m,迁移时间的RSD值可低至0.1%。该涂层毛细管还可以定量检测婴幼儿奶粉中乳铁蛋白(Lf)的含量,向婴幼儿奶粉样品中外加0.40 mg/mL的标准Lf后,检测到Lf的含量是(0.39±0.02) mg/mL,回收率可达97.8%±5.1%。这种涂层毛细管在分析婴幼儿奶粉样品时前处理简单,分离时间较短(6 min),涂层毛细管连续使用50次后,Lf迁移时间和峰面积的RSD值分别为1.1%和2.9%,为婴幼儿奶粉中Lf的检测提供了简单可行的方法。
2 PMOXA对BSA和溶菌酶(Lyso)的在线富集及检测信号放大作用
在CE-UV用于蛋白质的分析过程中,样品进样体积小，检测光程短,导致样品的检测灵敏度不高,不能达到痕量蛋白质的直接检测要求。解决上述问题的常见方法有:对样品进行前处理以提高样品的纯度、重新设计检测器、在线(on-line)富集目标分析物等[36,37]。其中在线富集技术不需要对仪器本身进行任何改造,主要通过改变目标分析物在毛细管内的迁移速率,使待测样品发生堆积,从而提高待测样品通过检测器的浓度,达到提高检测灵敏度的目的。常用的在线富集技术有堆积法、动态pH界面法、吹扫法、瞬间等速电泳法、毛细管涂层法等[38-41]。毛细管涂层法是指:将对蛋白质具有可逆吸附功能的聚合物涂覆在毛细管内壁,形成聚合物涂层毛细管,该涂层毛细管在某一条件下能吸附目标蛋白质,在另一条件下能将所吸附的目标蛋白质全部释放,具有富集目标蛋白质,提高蛋白质分析灵敏度的功能。
这种具有可逆吸附功能的聚合物通常具有刺激响应性,它可以对外界的某种刺激(如温度、pH值、光、溶剂、离子强度(I)等)做出相应的反应(如颜色、润湿性、蛋白质吸附等变化)[42-44]。聚丙烯酸(PAA)是一类常见的具有pH响应性的聚合物,随着环境pH值和离子强度的改变,PAA链在溶液中会溶胀和塌缩[45-47],从而达到对蛋白质的可控吸附与释放。研究发现,如果只是单纯的PAA组成的聚合物刷,只能释放出部分吸附的蛋白质;当PAA和具有抗蛋白质吸附的聚合物(如PEG)组成二元混合刷时[48-51],在一定条件下能吸附蛋白质,当改变条件时又能将所吸附的蛋白质几乎全部释放。Pan等[27]通过PDA将PMOXA和PAA依次接枝在不同的基底(如玻璃、硅、金等)上,制备了PMOXA/PAA二元混合刷。研究发现,当PAA的理论链长较PMOXA长,在pH=5.0(I=10-5mol/L)时,由于PAA链处于伸展状态,涂层可以吸附大量的BSA;而在pH=9.0(I=10-1mol/L)时,由于PAA链中羧基的解离,使涂层带负电,并且由于盐效应,PAA链发生塌缩,因此可将之前吸附的带负电荷的BSA释放出来,同时处于涂层表面的PMOXA会进一步阻止蛋白质的吸附。Gong等[52]进一步研究发现,当PAA的接枝密度约为PMOXA的一半,在pH=7.0(I=10-5mol/L)时,PAA链处于伸展状态,可以通过静电作用吸附带正电荷的Lyso;当pH=3.0(I=10-1mol/L)时,由于羧酸根的质子化以及盐效应,PAA链塌缩,减弱了PAA与Lyso之间的静电吸引作用,使之前吸附的Lyso得以释放,同时暴露在外的PMOXA链阻止了Lyso的进一步吸附,此时Lyso的脱附率可达91.3%(见图3)。
图 3 BSA或Lyso在PMOXA/PAA混合刷上的吸附和解吸附Fig. 3 Adsorption and desorption of BSA or Lyso on the PMOXA/PAA mixed brushes BSA: bovine serum albumin; Lyso: lysozyme; PAA: polyacrylic acid; I: ion strength.
将上述具有pH和I响应性的PMOXA/PAA混合刷修饰到毛细管内壁,可以通过改变缓冲溶液的pH和I,调控涂层对目标蛋白质的吸附和释放,释放的蛋白质在电渗流和电泳的双重作用下快速迁移,到达UV检测器的蛋白质瞬时浓度大大增加,使目标蛋白质得到富集,CE-UV对目标蛋白质的检测信号得到放大,从而达到提高低丰度蛋白质检测灵敏度的目的(见图4)。Liu等[53]通过PDA将PMOXA和PAA接枝在毛细管内壁,制备出PDA/PMOXA/PAA涂层毛细管,并将其用于BSA的在线富集。结果表明,在pH=5.0(I=10-5mol/L)时,涂层毛细管可吸附大量的BSA;在pH=9.0(I=10-1mol/L)时,吸附的BSA发生脱附。PDA/PMOXA/PAA涂层毛细管基于峰高和峰面积的灵敏度提高因子(SEF)分别为5 498和3 649,即BSA的稀溶液在聚合物涂层毛细管中得到了富集。Hou等[54]的研究结果表明,当PAA链长(12.5 nm)是PMOXA链长(8 nm)的1.56倍时,PDA/PMOXA/PAA涂层毛细管可以达到最佳的在线富集效果。在pH=7.0(I=10-5mol/L)时,Lyso可吸附在涂层毛细管内壁上;在pH=3.0(I=10-1mol/L)时,涂层与Lyso之间的静电作用大大减弱,大部分吸附的Lyso得以释放。该方法对Lyso的最低检出限达到4.5×10-9mg/mL,检测信号放大了1.0×105倍,极大提高了CE对Lyso的检测灵敏度。
图 4 PDA/PMOXA/PAA涂层毛细管对BSA或Lyso的在线富集机理Fig. 4 On-line preconcentration mechanism of BSA or Lyso in PDA/PMOXA/PAA coated capillaryEOF: electroosmotic flow.
