多靶点分子对接研究艾叶抗乙肝病毒的有效成分

王卫京，詹世平，丁仕强

（大连大学环境与化学工程学院，辽宁大连 116622）

1 概述

感染乙肝病毒（HBV）可导致慢性乙型肝炎，会发展成为肝硬化、肝癌等疾病。乙肝病毒感染是最严重的全球性公共卫生问题之一。目前用于抗乙肝病毒的药物有两种；

1）干扰素；

2）核苷类似物。

但这些药物对乙肝病毒只能功能性抑制，一旦乙肝病毒发生变异，就会对药物产生抗药性。因此，研究新型抗乙肝病毒药仍是一个十分紧迫的问题。

中药治乙肝的历史十分悠久，具有多途径，副反应小，价格便宜的特点，是研究抗乙肝病毒药物的一个重要领域。彭立生等研究了叶下珠提取物对乙肝病毒及X基因的抑制作用。王羿今利用数据挖掘研究了茵陈蒿汤治疗慢性乙肝的作用机制。赵志鸿等研究了艾叶提取物对乙肝病毒抑制作用，结果表明，艾叶提取物对HBsAg和HBeAg的分泌有明显的抑制作用，对HBV DNA的复制有一定的抑制作用，并呈剂量依赖性。

随着生物信息学的发展，分子对接技术也越来越多地应用于中药活性成分的分析。姚香草等采用分子对接研究了鸡骨草抗乙肝病毒的活性分子，对接分数较高的主要为三萜皂苷类、有机酸类、黄酮类及氨基酸类成分。孙砚辉利用分析对接技术辅助筛选了氧化苦参碱治疗乙型肝炎的蛋白结合靶标。周厚琴等通过分子对接技术分析了赤芍治疗胆汁淤积型肝炎的作用机制，筛选了其中有显著疗效的成分。

乙肝病毒属于嗜肝DNA病毒科，其病毒颗粒由病毒基因组、核衣壳和囊膜组成。HBV病毒基因组有四个开放阅读框，编码Core蛋白即核衣壳蛋白，pre-core蛋白，Pol蛋白，x蛋白以及S蛋白（L，M，S）。pre-core蛋白与HBeAg的合成与分泌有关，S蛋白是病毒包膜蛋白。与乙肝病毒复制有关的蛋白则为核衣壳蛋白，Pol蛋白即乙肝病毒聚合酶，以及x蛋白HBx。乙肝病毒核衣壳蛋白组成乙肝病毒核衣壳，对乙肝病毒的复制有重要作用。乙肝病毒聚合酶在装配新的病毒颗粒以及由RNA逆转录DNA的过程中起关键作用，是核苷类药物的作用靶点。乙肝病毒x蛋白HBx是一种多功能调节蛋白，它通过对信号通路、细胞周期等方面的调控，在HBV复制时起到重要作用。由于核衣壳蛋白，聚合酶以及HBx在乙肝病毒复制过程中作用十分重要，本研究就以这三种蛋白为靶点，筛选艾叶中的有效成分。

2 计算方法

艾叶的组分来源于TCMSP数据库，以分子量小于500，氢键给体数目小于5，氢键受体数目小于10为标准先对其进行一轮筛选。用iGEMDOCK将艾叶组分和三个靶点分别进行分子对接，初步筛选出30个与靶点对接较好的组分。然后再用Ledock做进一步筛选，筛选出10个与靶点对接能较低的组分。

乙肝病毒核衣壳蛋白的晶体结构来源于蛋白质数据库（http：//www.rcsb.org），PDB ID为5E0I，其结构如图1所示。乙肝病毒聚合酶的晶体结构还没有解析出来，本研究利用同源模建的方法构建其三维结构。首先在美国国立生物技术信息中心（NBCI）数据库中找到乙肝病毒聚合酶的一级序列BAQ95565.1，然后利用BLAST程序在PDB库中找到其同源性最高的蛋白质晶体6IK9作为建模模板，二者序列同源性为29.64%。在SWISS-MODEL网站进行同源模建，得到的蛋白质模型经拉氏图评估后，其有1.4%的氨基酸不在合理区间内，模型较为合理。该模型结构，如图2所示。

图1 核衣壳蛋白结构

图2 聚合酶模型结构

蛋白HBx目前也没有解析出其晶体结构，而且在NBCI数据库中也没有找到与其同源性较强的蛋白质，但其含有154个氨基酸，氨基酸数目较少，故对其三维结构采用从头预测的方法建模。在NBCI数据库中找到该蛋白质的一级序列BAQ95563.1，上传该序列至从头预测网站QUARK，建立该蛋白质模型。该模型经拉氏图评估后，有5.5%的氨基酸在不合理区间内，模型较为合理。得到的模型结构如图3所示。

图3 HBx蛋白模型结构

3 结果与讨论

经过两轮对接后，艾叶组分中与各靶点对接能位于前10的组分，如表1、2、3所示。

表1 艾叶组分与核衣壳蛋白的对接结果

表2 艾叶组分与聚合酶的对接结果

从表中的对接结果来看，总体上艾叶组分与乙肝病毒聚合酶的对接能最低，其次是HBx蛋白，而与核衣壳蛋白的对接能则与前两个蛋白有一定差距。这表明艾叶对乙肝病毒的抑制作用主要是通过抑制聚合酶和HBx蛋白来实现，而对核衣壳蛋白的抑制作用相对较弱。很有可能聚合酶和HBx蛋白就是艾叶组分的作用靶点。

表3 艾叶组分与HBx蛋白的对接结果

从表2和表3可以看出，艾叶组分和聚合酶及HBx蛋白对接能均较低，其中与聚合酶的结合能整体上还要更低一点，这说明艾叶组分与聚合酶的结合能力更强一些。图4和图5分别是艾叶组分与HBx蛋白和聚合酶的对接位点情况。从图4可以看出，不同艾叶组分与HBx的对接位点非常集中，能够很好地抑制该蛋白的活性，但艾叶组分与聚合酶的结合就比较分散，特别是在图5中，箭头所指的有可能是逆转录活性区域，只有一个组分quercetin与之结合。在乙肝病毒中，HBx是一个多功能蛋白，它通过对细胞中各种蛋白及信号通路的调控，在HBV基因转录中起重要作用。HBV的RNA则是通过聚合酶逆转录成DNA，再装配成新的病毒。而对接结果表明，艾叶组分对HBx蛋白活性抑制作用较强，进而也就抑制了HBV基因转录成RNA，然后再翻译成蛋白质的过程。虽然艾叶组分与聚合酶的对接能较低，但位于可能的逆转录活性区域的组分却只有一个，导致整体上艾叶组分对DNA的复制抑制作用较弱。这从侧面印证了赵志鸿等[3]经实验得到的结论：艾叶提取物可能作用于HBV的蛋白表达水平，而不在DNA复制阶段。

图4 艾叶组分和HBx的对接位点

图5 艾叶组分和聚合酶的对接位点

在艾叶组分中，quercetin、eupatilin以及（2R）-5，7-dihydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）chroman-4-one均对三个靶点起到抑制作用，这体现了中药的特点，即多个组分对多个靶点作用，使病毒很难产生抗药性。组分quercetin对三个靶点均有较强的抑制作用，值得进一步研究。

4 结论

在乙肝病毒中，乙肝核衣壳蛋白，聚合酶以及HBx蛋白均对乙肝病毒的复制起重要作用。本文以这三种蛋白为靶点，用分子对接软件iGEMDOCK和Ledock对艾叶组分进行研究。对接结果显示，艾叶组分主要对HBx蛋白的抑制作用较强，而对核衣壳蛋白抑制作用较弱。艾叶组分和聚合酶的对接能虽然较低，但对接位点分散且在可能的逆转录区域结合组分少，削弱了艾叶组分对聚合酶的抑制作用。在艾叶中，多种组分对靶点蛋白有抑制作用，其中quercetin对三个靶点均有较强的抑制作用。