QuEChERS-气相色谱-串联质谱法检测鱼腥草中121种农药残留

苟 琰，高 驰，邓晶晶，耿 昭*，袁 军，李 敏,*，周 娟，郭 力，包晓明

（1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137；2.四川省食品药品检验检测院，国家药品监督管理 局中成药质量评价重点实验室，四川 成都 61173 1；3.岛津企业管理（中国）有限公司，四川 成都 610023）

鱼腥草又名折耳根、猪鼻拱、紫蕺、臭菜等，在我国有广泛分布。原植物为三白草科植物蕺菜（Houttuynia cordataThunb.）[1]，具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋的功效，现代研究证明其具有较好的抗炎活性[2-3]。作为药食两用植物，鱼腥草在我国有着悠久的食用历史[4]，其营养价值高，成分含量丰富，不仅可以作为蔬菜食用，还常被作为茶饮品[5]，深受云、贵、川、渝、湘等地老百姓喜爱，并广泛出口至日、韩等国[6-7]。据产出效益统计，其食用产出值已经是药用产出的数倍[8-9]，有十分广阔的开发利用价值。随着市场需求的不断增大，全国各产区均大力研发栽培品种及技术[10]。然而，在大面积生产种植过程中，对于病虫害[11]的防治不乏要使用到各种农药[12]，在当前倡导有机、绿色的食品环境下，控制鱼腥草中农药残留是不容忽视的问题，同时农药的不合理使用也存在着一定的安全风险[13]。近年来，关于鱼腥草中农药残留检测研究有一定报道[14-15]，但综合考量，其所涉及到的农药种类较少，缺乏较为系统的研究和数据，难以满足当前不断提高的检验检测要求。农药多残留检测[16-19]目前获得了广泛的关注，色谱-质谱联用技术[20-23]是目前最为重要的农药多残留检测方法，具有高灵敏度、专属性强、定性定量同时进行、高通量等优点。QuEChERS[24-25]（quick, easy, cheap, effective,rugged, and safe）是近年来国际上发展起来的一种农药残留检测的快速样品前处理技术，最先应用于蔬菜水果中，其简单有效、安全快速的特点非常适合于基质复杂的样品前处理[26-28]。鱼腥草含有挥发性成分、黄酮类、皂苷类等多种成分[29]，基底较为复杂。本研究采用气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GCMS/MS）技术结合QuEChERS样品前处理法建立快速筛查鱼腥草中121 种农药残留的检测方法，并应用于所收集到的大批量具有代表性的鱼腥草样品，旨在为鱼腥草的规范化种植生产和市场安全监管提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试样品来源均为市场购买和产地采集，涵盖野生和种植基地样品，共68 批，分别来自四川、贵州、福建、云南、湖北等全国主要产区。

WondaPak QuEChERS乙酸钠提取包、WondaPak QuEChERS 15 mL C18/PSA/GC-e/硅胶净化管 美国Agilent公司；乙腈、丙酮（均为色谱纯） 美国Fisher Chemical公司；乙酸（分析纯） 成都科龙化工试剂厂；农药对照品溶液（100～1 000 μg/mL）、农药对照品（纯度＞95%） 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司、美国AccuStandard Inc公司、农业部环境保护科研监测所、北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TQ8040 GC-MS/MS联用仪 日本Shimadzu公司；Millipore Q超纯水器 美国Millipore公司；MS3 digital涡旋振荡器 德国IKA公司；3-30k离心机 德国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 标准贮备液及工作溶液的配制

溶液型对照品，质量浓度为100～1 000 μg/mL，作为标准贮备液；固体对照品，精密称取适量，用乙腈溶解，配制成1 000 μg/mL的标准贮备液。均于－40 ℃保存。

在配制混合标准工作液时，充分考虑到每个化合物的响应情况，最终配制质量浓度各有不同：分别移取适量的标准贮备液，用丙酮配制成40～5 000 ng/mL的混合标准溶液，作为混合标准工作液。

1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 样品提取

样品用打粉机粉碎，过三号筛孔径（355±13）μm，称取2 g（精确至0.01 g），至50 mL聚苯乙烯离心管中，加入1%乙酸溶液15 mL，涡旋30 s，使药粉充分浸润，放置30 min，精密加入乙腈15 mL，置涡旋振荡器上剧烈振荡（3 000 r/min）5 min，－40 ℃放置20 min，加入无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合粉末（质量比4∶1）7.5 g，立即摇散，再置涡旋振荡器上3 000 r/min剧烈振荡5 min，然后5 000 r/min离心5 min后待净化。

1.3.2.2 样品净化

取上清液8 mL，转移至预先装有900 mg无水硫酸镁、300 mgN-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、300 mg十八烷基硅烷键合硅胶、300 mg硅胶、90 mg石墨化碳黑的离心管中，盖紧离心管，涡旋5 min使净化完全，5 000 r/min离心5 min。

1.3.2.3 浓缩及溶剂替换

精密量取上清液3 mL，40 ℃氮吹至近干，用丙酮定容至2 mL，离心，取上清液上机分析。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Agilent DB-17MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：60 ℃保持1 min，以30 ℃/min升至120 ℃，以10 ℃/min升至160 ℃，以2 ℃/min升至230 ℃，以15 ℃/min升至300 ℃，保持6 min，最后以20 ℃/min升至320 ℃，保持10 min；进样量1 μL，不分流；柱流速为线速度控制模式，初始流速1.3 mL/min；进样口温度240 ℃。

1.3.4 质谱条件

电子电离源；电子能量70 eV，离子源温度200 ℃；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式；碰撞气为氦气；溶剂延迟时间5 min。

1.4 数据处理

通过岛津Labsolution软件进行数据分析和图像处理。

2 结果与分析

2.1 仪器条件确定

选择对中低极性化合物分离较好的毛细管柱色谱柱DB-17MS，通过SCAN模式扫描，确定农药的保留时间，通过对定性定量离子的确定及碰撞电压的优化后，建立MRM模式方法，每种农药选择1 对定量离子，2 对定性离子，按照保留时间顺序分段检测。每种农药的保留时间、定量离子、定性离子见表1。农药混合对照品总离子流图见图1。

图1 121 种农药混合对照品MRM总离子流图Fig. 1 MRM total ion chromatograms of mixed standard solution of 121 pesticides

2.2 样品前处理条件优化

乙腈作为QuEChERS法中最为常用的提取溶剂，适用于提取极性范围较宽的多种农药，对水果蔬菜等含水量较高的样品即可直接提取，但对于含水量较低的样品，如果直接加乙腈进行提取，其提取效率往往不高。此次收集到的鱼腥草样品即是如此，故在提取前加入水浸泡，促使样品溶胀，以提高提取效率。另外考虑到QuEChERS提取包最佳使用环境为弱酸性，在水中加入1%乙酸溶液调整其pH值。

样品经乙腈提取后，如果直接加萃取盐包，会立即剧烈放热，不利于待测成分的检测，考察在加萃取盐包前放置在冰浴中20 min和直接放入冰箱冷冻室20 min，表明冰浴中放置的样品在加入盐包后仍会有较高的温度，而冰箱冷冻放置则可显著改善此情况。

鱼腥草其主要成分包括黄酮类、苷类、挥发油类成分，其全草均可食用，叶部分色素含量较高，在农残检测中，此类成分所带来的基质对于农药检测的干扰非常大；另外，由于大多数待测目标物均属于中低极性化合物，而鱼腥草中的挥发油类成分极性也较低，同样会带来一定程度的基质干扰，因此净化除杂步骤尤为重要。本课题组结合前期的大量基础工作[30]，将目前常用的样品前处理方法分为3 种，第1种是基质对目标物不存在太大干扰的品种，可以在充分保证准确性的情况下，采用乙腈直接提取不净化的方式进行前处理；第2种和第3种方法为对于存在较大干扰需要进行净化的基质，在乙腈提取后，分别采用QuEChERS和SPE小柱进行净化，QuEChERS净化填料包括一定比例的PSA、石墨化碳、C18、硅胶及无水硫酸镁；SPE方法包括石墨化碳柱、HLB柱、弗罗里硅土及氨基柱等。由于QuEChERS为复合净化包，对杂质的净化优于单一净化填料，另外QuEChERS操作较为简单，更能保证结果的稳定性，综合考虑后，选用QuEChERS进行净化，另外除考察1.3.2.2节中净化方法，同时也采用专门针对脂质成分的EMRLipid dSPE（增强型脂质去除净化管（Agilent公司））进行净化效果筛选。结果，2 种方法从对基质的干扰情况看，无明显差异（图2、3），而EMR-Lipid dSPE方法操作较为繁琐，步骤更多，可能更易出现待测目标物损失的情况（图4），故采取1.3.2节所述方法。

图2 灭线磷母离子及其子离子色谱图Fig. 2 Chromatograms of precursor and product ions of ethoprophos with sample clean-up by QuEChERS or EMR-Lipid dSPE

表1 121 种农药的质谱参数、保留时间、混标质量浓度、监测离子对、碰撞电压、相关系数（ r）、线性范围、精密度、平均回收率、RSD及检出限Table 1 Mass spectrometric parameters, retention times, mixed standard concentrations, monitoring ion pairs, collision energy, correlation coeffificients ( ),linear ranges, precision, average recoveries, RSDs and limits of detection of 121 pesticides

续表1

图3 嘧霉胺母离子及其子离子色谱图Fig. 3 Chromatograms of precursor and product ions of pyrimethanil with sample clean-up by QuEChERS or EMR-Lipid dSPE

图4 丙环唑母离子及其子离子色谱图Fig. 4 Chromatograms of precursor and product ions of propiconazole with sample clean-up by QuEChERS or EMR-Lipid dSPE

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系与检出限

取空白基质样品3 g，按1.3.2节方法处理，在用净化包进行净化后，精密量取上清液3 mL，置氮吹仪上于40 ℃水浴浓缩至近干，分别加入混合标准工作液（表1）2 000、1 000、500、250、125、50、25、10、5 μL，加丙酮定容至2 mL，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，即得系列基质混合对照品溶液（分别作为ST1～ST9）。按1.3.3节和1.3.4节进行测试，经选择离子定量扫描，以峰面积为纵坐标、以质量浓度为横坐标作标准曲线，得各农药的线性回归方程和相关系数。根据化合物响应情况，分别以ST8和ST9进行检出限计算，以定量离子信噪比RSN=3为样品检出限。结果表明，121 种农药线性良好，检出限绝大多数小于0.01 mg/kg（表1）。

2.3.2 精密度与回收率

取标准曲线ST6，连续进样6 次，计算各目标物响应相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）（表1）。样品称量后，分别精密加入混合对照品贮备液各0.05 mL（3 倍检出限）、0.1 mL（6 倍检出限）、0.25 mL（15 倍检出限），样品经1.3.2节方法处理后，每浓度各重复3 次，共9 份，结果回收率在60%～140%范围内的农药数占总数的90.9%，86.8%的农药RSD小于15%（表1）。

2.4 样品测定结果

来自全国主要产区68 批样品种共检出27 种农药，结果表2。

表2 样品检出批次及检出范围Table 2 Detection rates and concentration ranges of 27 pesticides in 68 sample batches

表3 不同来源样品检出农药种类Table 3 Number of pesticide detected in Houttuynia cordata Thunb.from different geographical regions

续表3

由表3可知，鱼腥草中农残检出率接近50%，野生和栽培、自采和购买的样品中都有检出，检出率相差不大，说明使用农药是比较普遍的情况。29 批有检出的样品中，共检出27 种农药，仅检出1 种农药的批次为14 批，检出2 种及以上农药的批次为15 批，有甚者1 批样品检出10余种农药，且残留量均处于较高水平，说明目前尚有不少鱼腥草栽培种植中的农药使用仍处于较为混乱的状态。

3 讨论与结论

参考GB 2763—2016《食品中农药最大残留限量》[31]及NY/T 2874—2015《农药每日允许摄入量》[32]，检出的农药中，氯氰菊酯、毒死蜱、三唑醇、多效唑、氟氯氰菊酯属于残留量较高，甲氰菊酯、毒死蜱、腐霉利属于检出率较高，另外，如丙溴磷、五氯苯胺等属于中等毒性农药，以上农药均值得关注。

农药残留检测属于痕量检测，鱼腥草作为药材和蔬菜主要食用部位为地上部分或全草，样品基质中色素和脂溶性成分在前处理过程中应尽量除去，本研究在实际操作采用的QuEChERS法获得比较满意的效果，90.9%的农药回收率在60%～140%之间[33]，根据回收率添加水平分析，能较为准确地定性和定量；对于可能由于化合物性质或者基质影响的原因造成回收率偏高或偏低的农药，此方法可作为筛查方法，如需要准确定量，可以采用以回收率进行折算的方式获得更为准确的结果。本研究操作简便、稳定性高，大幅提高了检测通量。通过广泛收集样品的数据累积，对有检出农药残留品种进行风险评估，为鱼腥草中农残检测和限量制定提供数据支持，以促进其进一步规范种植和减少安全风险。