酵母抽提物滋味成分分析及其复合调味料对鲢鱼风味的影响

任佳怿，翟营营,*，黄晶晶，张慧敏，熊善柏，黄琪琳,*，朱建忠，李 沛，李 库，沈 硕

（1.华中农业大学食品科技学院，国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心（武汉），湖北 武汉 430070；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）又称白鲢、白鱼，属硬骨鱼纲、鲤形目、鲢科、鲢亚科，是一种典型的滤食性鱼类，生长速度快，抗病性强，产量高，是我国主要养殖鱼类之一[1]。2017年我国淡水养殖总产量2 905.29万 t，其中鲢鱼产量为385.28万 t，位居第二[2]。鲢鱼蛋白质含量丰富，富含多种必需氨基酸，生物学效价高，多不饱和脂肪酸如二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等含量丰富，具有很高的营养价值[3-4]。清蒸的熟制方法能最大程度保持鱼肉的营养价值，成品口感咸鲜，鱼肉软嫩，鲜香味美。虽然新鲜鲢鱼营养丰富，但消费者对其接受度不高，主要原因是鲢鱼鱼肉滋味寡淡且腥味较重，因此，如何增强鱼肉的鲜味，有效掩蔽其腥味成为一个亟待解决的问题。

酵母抽提物（yeast extract，YE）是由酵母细胞内的水溶性成分（主要是糖和氨基化合物）经酶解、浓缩制成的糊状（约80%固体）或粉末状（约96%固体）的浓缩物[5]。它与其他从肉类、植物、鱼类中提取的成分一样，是一种天然调味料，具有复杂的调味特性，主要体现在改善产品的鲜味、咸味、酸味、苦味和丰富度等方面，而这些是化学调味料所不具备的，因此也被称为“第三代味精”[6]。此外，YE中还可以选择性添加焦糖、蔬菜浓缩物、香料、味精（monosodiumL-glutamate，MSG）和5’-核苷酸，进一步丰富其调味特性[7-8]。GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》中明确规定，YE具有食品属性，属于一种天然食品配料，在食品加工中没有使用范围和添加量限制。近年来，YE作为一种具有丰富调味特性的天然调味料在食品中得到了广泛的应用[9]，但是目前还鲜见将其应用在鲢鱼增鲜去腥方面的研究。因此本实验对YE的滋味成分进行分析，通过减除实验和添加实验确定YE中滋味的主要贡献成分，再以白鲢鱼片为研究对象，通过单因素试验和正交试验确定YE增鲜去腥的最优配比。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白鲢鱼 华中农业大学农贸市场；高核苷酸型YE（FIG18LS） 安琪酵母股份有限公司；核苷酸标准品（色谱纯） 上海源叶生物技术有限公司；甲醇（色谱纯）国药集团化学试剂有限公司；天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、精氨酸（食品级） 郑州安安康食品有限公司；5’-CMP、5’-GMP、5’-IMP、5’-AMP（食品级） 浙江一诺生物科技有限公司；食盐（食品级）重庆索特盐化股份有限公司；蔗糖（食品级） 华海顺达粮油调料有限公司。

1.2 仪器与设备

Avanti J-26xp型高速冷冻离心机 贝克曼库尔特有限公司；L-8900型氨基酸自定分析仪 日立高新技术公司；e2692高效液相色谱仪 美国Waters公司；TS-5000Z电子舌 日本Insent公司。

1.3 方法

1.3.1 游离氨基酸组成分析

准确称取1.0 g YE，加入20 mL混合液（0.1 mol/L盐酸-10%三氯乙酸1∶2）后旋涡振荡，40 kHz超声15 min；12 000 r/min离心20 min，取上清液10 mL，4 ℃静置1 h，再以12 000 r/min离心20 min，取上清液5 mL，过0.22 μm滤膜，用氨基酸自动分析仪测定。

1.3.2 核苷酸组成分析

采用Pei Fei等[10]的方法并作适当修改。准确称取1.0 g YE溶于50 mL超纯水中，沸水浴1 min，冷却后过0.45 μm滤膜备用。

色谱条件：色谱柱：大连依利特Hypersil ODS2-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：50 mmol/L磷酸二氢钾，超声脱气后使用；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；检测波长254 nm；检测时间20 min。

1.3.3 减除实验

参考文献[11-14]的方法，并作适当修改。将FIG18LS中测得的17 种游离氨基酸和4 种核苷酸共21 种组分配制成全组分溶液进行减除实验。如果减除某种组分后，样品滋味发生了显著变化，则认为该组分是YE的主要滋味活性成分。为将样品全部溶解且降低对感官评价员味觉的损坏，样品溶液需稀释50 倍后进行感官评价。感官采用“三点检验法”进行评价，7 个感官评价员进行3 次重复评价，然后对获得的21 组数据进行统计学分析。

1.3.4 添加实验

参考文献[11-14]的方法，并作适当修改。将减除实验中确定的n种滋味活性成分混在一起，组成混合溶液，再将减除实验中的非滋味活性成分逐一加入，通过感官评价判断其滋味变化，确定对滋味影响较大的组分。感官评价方法同1.3.3节。

1.3.5 单因素试验

将新鲜白鲢鱼清洗干净后“三去”（去头、去鳞、去内脏），切割成规则片状（5 cm×4 cm×1 cm）[15]。准确称取白鲢鱼片200 g，用不同配比的调味料涂抹均匀后腌渍30 min，蒸煮10 min。以食盐、YE和蔗糖为影响因子，预实验确定较适宜的添加量分别为1.5%食盐、1% YE、1%蔗糖。在此基础上分别按照食盐质量分数0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，YE质量分数0%、0.5%、1%、1.5%、2%，蔗糖质量分数0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%分别进行单因素试验。

1.3.6 正交试验

通过单因素试验确定各因素水平后，再进行3水平3因素L9（33）正交试验。正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验设计因素与水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of factors used in orthogonal array design

1.3.7 清蒸鲢鱼片感官评价

感官评价小组由10 名经过严格培训的评价员组成，男女各5 名。所有样品在室温下统一评定。要求评价员在评价之前和评价过程中禁止使用有香味的化妆品，且至少在评价前60 min避免接触香烟及其他强烈味道或气味。手上不应留有洗涤剂的残留香气。感官评价表如表2所示，满分60 分。根据各指标对滋味影响的程度赋予不同的权重：色泽0.1，气味（嗅闻）0.15，气味（咀嚼）0.15，滋味0.4，组织状态0.1，口感0.1。最后将总分换算为100 分。

表2 感官评价标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of steamed silver carp fillets

1.3.8 电子舌分析

参考王慧等[16]方法并作适当修改。准确称取蒸熟的鱼片30 g于烧杯中，加入200 mL去离子水，均质后静置20 min，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，过滤后取80 mL倒入电子舌专用进样杯中，于室温完成测定。将每个样品的数据采集时间设置为120 s，以1 s为周期采集数据，选取第120秒出现的响应值作为电子舌原始数据信号。电子舌传感器每次检测后均用去离子水进行清洗，清洗周期10 s。

1.4 数据分析

1.4.1 滋味活度值（taste active value，TAV）的计算

TAV的计算公式如下：

式中：C为滋味物质的含量/（mg/g）；T为滋味物质的阈值/（mg/g）。

当TAV≥1时，表明该滋味物质对样品滋味有显著影响，且数值越大贡献越大；当TAV＜1时，表明该滋味物质对整体滋味贡献不显著[17]。

1.4.2 味精当量（equivalent umami concentrations，EUC）的计算

EUC表示与两类鲜味物质混合物协同作用产生同样的鲜味强度相当于MSG的量[18-19]，按式（2）计算：

式中：ai为鲜味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）的含量/（mg/g）；bi为鲜味氨基酸相对于MSG的相对鲜度系数（谷氨酸：1；天冬氨酸：0.077）；aj为呈味核苷酸（5’-IMP、5’-GMP、5’-AMP）的含量/（mg/g）；bj为呈味核苷酸相对于IMP的相对鲜度系数（5’-IMP为1；5’-GMP为2.3；5’-AMP为0.18）；12.18为协同作用常数。

实验数据以Origin Pro 2015进行处理，采用SAS 9.2进行ANOVA单因素方差分析及Duncan检验（P＜0.05），以表示。

2 结果与分析

2.1 游离氨基酸组成及TAV

表3 YE游离氨基酸组成及TTAAVVTable 3 Free amino acid composition and taste activity value of yeast extrraacctt

由表3可知，YE游离氨基酸总量为171.49 mg/g，谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸总量为134.4 mg/g，占氨基酸总量的78.37%，是YE最主要的氨基酸。根据YE中氨基酸的呈味特性将氨基酸分为3 类，即鲜味/酸味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸[21]。由表3可知，YE中鲜味/酸味氨基酸含量最高，占氨基酸总量的48.33%，甜味氨基酸含量次之，苦味的氨基酸则只占氨基酸总量的17%；谷氨酸、丙氨酸和精氨酸是3 类氨基酸中含量最高的呈味氨基酸。精氨酸虽是苦味氨基酸，但呈现的是一种令人愉悦的苦味[22]。

谷氨酸的TAV为233.33，远高于其他氨基酸，表明其对YE滋味贡献最大。谷氨酸本身呈酸味，但当其以钠盐形式存在时具有很强的鲜味；丙氨酸是除谷氨酸外，对YE滋味贡献最大的氨基酸。苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸的TAV小于1，说明它们对YE滋味贡献程度较小。

2.2 YE核苷酸组成及TAV

表4 YYEE 55’-核苷酸组成及TTAAVVTable 4 5’-Nucleotide composition and taste activity value of yeast extract

5’-核苷酸是食品中常见的风味增效剂，在核苷酸的多种异构体中，只有5’-核苷酸才能显示出鲜味增效作用；另外，5’-核苷酸6位上的羟基是产生风味增效作用所必需的[23]。5’-肌苷酸（5’-IMP）和5’-鸟苷酸（5’-GMP）6位上均为羟基，因此增鲜效果最强[24]。由表4可知，YE中5’-IMP的含量最高，5’-GMP次之，两者占核苷酸总量的70.38%。5’-CMP含量虽然较高，但是由于结构不含羟基，对风味几乎没有影响。5’-AMP含量最低且其6位上是氨基，增鲜效果远不及5’-IMP和5’-GMP。通过计算TAV可知，5’-GMP和5’-IMP的TAV分别为433.12和353.92，远高于谷氨酸的TAV，表明在YE中5’-核苷酸对滋味的贡献程度大于氨基酸；5’-AMP的TAV仅为2.9，对YE滋味的贡献程度较小。

2.3 减除实验

表5 YE减除实验结果（一）Table 5 Omission test results of yeast extract (1)

将YE中主要滋味成分分成4 组进行减除实验，每次实验减去一个组分，通过感官评价其滋味变化。结果如表5所示，当A、B组和D组成分缺失时，YE的滋味发生了显著变化。当A组成分缺失时，混合溶液鲜味显著降低，咸味降低，回味不持久；当B组成分缺失时，混合溶液鲜味和咸味都降低，但是差异程度略低于A组；当C组成分缺失时，混合溶液滋味基本没有变化；当D组成分缺失时，混合溶液的鲜味、咸味均显著降低，且降低程度略高于A组，同时混合溶液甜味变得明显；其他滋味类型变化不明显。因此，根据上述结果，在减除实验（二）中仅将有显著性差异的组（A、B、D组）中的组分进行单独减除。

表6 YE减除实验结果（二）Table 6 Omission test results of yeast extract (2)

将组分减除后滋味发生明显变化的3 个组中的每一种组分单独减除，减除实验的结果如表6所示。A组中谷氨酸钠、丙氨酸、天冬氨酸钠、精氨酸，D组中5’-GMP、5’-IMP减除后混合溶液的滋味发生了显著变化。当谷氨酸钠、丙氨酸缺失时，混合溶液的咸味、酸味和鲜味显著降低，谷氨酸钠缺失时滋味的差异程度高于丙氨酸；天冬氨酸钠和精氨酸缺失时，混合溶液的咸味和鲜味显著降低，甜味却显著提高，尤其是精氨酸缺失时，甜味提升最为明显；5’-GMP缺失时混合溶液的甜味上升但鲜味下降；5’-IMP缺失时咸味、甜味和鲜味均显著降低。B组中的组分在全部缺失时对混合溶液的滋味有显著影响，但当分别减除时，混合溶液的滋味没有显著变化，表明B组对混合溶液滋味的影响是各组分共同作用的结果。

2.4 添加实验

表7 添加实验结果Table 7 Addition test results of yeast extract

将减除实验中确定的6 种滋味活性成分配制成混合溶液，将非滋味活性成分逐一加入，通过感官评价分析混合溶液的滋味变化。

由表7可知，只有当酪氨酸和5’-AMP加入后，混合溶液的滋味发生了显著变化，其他组分的加入对混合溶液的滋味均没有显著影响。当加入酪氨酸后，混合溶液的咸味下降，酸味和鲜味上升，同时伴有较浓厚的氨味；当加入5’-AMP后，混合溶液的咸味和甜味下降，鲜味增加。

通过减除实验和添加实验共确定了8 种滋味活性成分，分别为谷氨酸钠、丙氨酸、天冬氨酸钠、精氨酸、5’-GMP、5’-IMP、酪氨酸和5’-AMP。当混合溶液中缺失或者添加这些组分时，会对YE的滋味产生显著影响。

2.5 EUC分析

表8 YE鲜味成分含量及EEUUCCTable 8 Contents of umami components in yeast extract and its EUC

滋味物质间存在复杂的相互作用，TAV只能评价单一滋味成分对滋味的贡献，而无法将物质间的协同作用考虑在内。Yamaguchi等[25]在研究中发现了鲜味氨基酸和鲜味核苷酸的相互作用，并提出用EUC表示。Mau[26]则将EUC划分为3 个等级，即＞10 g/g、0.1～10 g/g、＜0.1 g/g。由表8可知，鲜味物质总量仅为0.23 g/g，与EUC值之间存在较大差距，表明鲜味物质间存在很强的相互作用。该YE的EUC值为184.48 g/g，即1 g该YE在这种协同作用下产生的鲜味强度相当于184.48 g MSG所产生的鲜味强度，远大于Mau[26]划分的第一个等级，表明该YE具有很强的协同增鲜效果。

2.6 单因素试验结果

2.6.1 YE添加量对清蒸鱼片风味的影响

图1 YE添加量对清蒸鱼片风味的影响Fig. 1 Effect of yeast extract addition on the flavor of steamed silver carp fillets

由图1可知，当YE添加量为1%时感官评分最高，增鲜效果最好，当添加量超过1%时，感官评分下降。这是由于YE添加量过高时，鱼片鲜味过重且滋味变得酸涩，此时鱼片呈现较重的YE的特征气味，掩盖了鱼片本身的滋味，使其评分降低。

2.6.2 食盐添加量对清蒸鱼片风味的影响

食盐的加入有利于YE中的谷氨酸转变为谷氨酸钠，提高食物的鲜味；同时鲜味的增强也会使食盐的咸味得到缓和[27-28]。由图2可知，当食盐添加量为1%时，感官评分得到最大值。当不添加食盐或食盐添加量较低时，鱼片滋味寡淡，鲜味较低；当食盐添加量超过1.5%时，感官评分迅速下降，此时鱼片具有明显的咸味，而且过重的咸味也掩盖了对鲜味的感知。

图2 食盐添加量对清蒸鱼片风味的影响Fig. 2 Effect of salt addition on the flavor of steamed silver carp fillets

2.6.3 蔗糖添加量对清蒸鱼片风味的影响

在鲜味物质中添加适度的糖可以起到去除腥味降低油腻感的效果；但糖添加过多时会掩盖鲜味，甚至产生不良风味[23]。由图3可知，当蔗糖添加量为1%时，鱼片感官评分最高。感官评价过程中明显的发现，当蔗糖添加量超过1.5%时，鱼片会呈现明显的甜味，且随添加量的增加，甜味愈加明显，对鲜味的掩盖作用愈强。

图3 蔗糖添加量对清蒸鱼片风味的影响Fig. 3 Effect of sugar addition on the flavor of steamed silver carp fillets

2.7 正交试验结果

2.7.1 感官评价正交试验结果

表9 正交试验感官评价结果Table 9 Orthogonal array design with sensory evaluation results

由表9可知，添加YE后对于鱼片色泽有显著影响，且影响程度随YE添加量的增加而增大。添加YE可以很好地掩蔽鱼肉腥味，并能赋予鱼片浓厚的肉香味。有研究表明，YE含有多种呈烤香及肉香的气味活性化合物，如吡嗪类和噻吩类等，可以对鱼腥味起到很好的掩蔽作用[29-30]。添加YE可使鱼片滋味醇厚，回味持久，但对滋味的促进作用并不随YE含量的增加而增加；滋味得分最高的第1组其YE添加量为1%，当添加量为1.5%时，滋味得分反而出现了下降的趋势。综合各指标的感官评价得分，第1组的评分最高。

2.7.2 正交试验设计与总分结果

在单因素试验的基础上，采用3因素3水平正交试验研究增鲜去腥调味料的最佳配比。试验设计与总分结果如表10所示。

对不同试验组进行感官评价，并将其综合评价结果进行分析。通过极差分析可以得知，影响清蒸鱼片风味的因素主次为A＞C＞B，即在试验各因素范围内，食盐对清蒸鱼片的影响最大，其次为蔗糖，最后为YE。方差分析可知（表11），食盐添加量对感官评分影响极显著（P＜0.01），YE和蔗糖的添加量对感官评分影响不显著。综合考虑，选择增鲜去腥调味料配比的最优方案为A1B1C1，即食盐添加量1.5%、YE添加量1%、蔗糖添加量0.5%。

表10 感官评价总分正交试验设计与结果Table 10 Results of orthogonal test

表11 感官评价总分方差分析Table 11 Analysis of variance of sensory evaluation results

2.8 电子舌分析

2.8.1 电子舌信号的主成分分析

图4 清蒸白鲢鱼片电子舌响应信号主成分分析Fig. 4 PCA plot of electronic tongue data for steamed silver carp fillet

由图4可知，2 个主成分贡献之和为96.65%，表明这两个主成分可以很好的代表样品的总体滋味特征。图中空白鱼片主要沿第1主成分轴正向分布，而调理后的鱼片则向第1主成分轴的负方向移动，在第2主成分轴上分布较为集中；2 个样品组之间空间分布距离较远，表明调理之后的鱼片滋味发生了很大变化。实验结果表明，电子舌可以有效的将空白鱼片和调理后的鱼片区分开。

2.8.2 电子舌分析鱼片滋味的变化

如图5所示，电子舌分析结果表明，空白鱼片苦味明显，酸味较轻。经过增鲜去腥调味料腌渍以后，鲜味得到了明显的提高，咸味增加较为显著，酸味略有增加，苦味显著降低，丰富性、收敛性和回味变化不明显。

图5 清蒸鲢鱼片滋味雷达图Fig. 5 Taste radar chart of steamed silver carp fillets

3 结 论

YE滋味物质含量丰富，其中谷氨酸钠、丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、5’-IMP、5’-GMP、酪氨酸、5’-AMP是其滋味的主要贡献成分，且鲜味氨基酸（谷氨酸钠和天冬氨酸钠）与鲜味核苷酸（5’-GMP、5’-IMP和5’-AMP）存在显著的协同增鲜效果，使得该YE的鲜度极高（EUC高达184.48 g/g）。因此以该YE为配料之一，加以食盐和蔗糖开发鱼制品的增鲜去腥复合调味料。结果发现YE、蔗糖、食盐添加量为1%、0.5%、1.5%时，组成的复合调味料能使清蒸鱼片的鲜味增强，苦味和腥味减弱，具有很高的实用价值。