芪蛭降糖片对糖尿病大鼠胰岛损伤的保护机制

周 琳，李海云，闫桂溪，王越华，杜钢军

河南大学药学院 药物研究所，河南 开封 475004

目前糖尿病治疗药物包括胰岛素、双胍类、磺脲类及胰岛素增敏剂等，虽然降糖作用肯定，抗药性、胃肠道反应及肝肾毒性等不良反应明显，且对恢复胰岛功能作用不大[1-3]。芪蛭降糖片[4-6]由黄芪、水蛭、地黄和黄精组成的防治糖尿病血管并发症的药物。最早是林兰教授通过结合自身治疗多年糖尿病的经验，针对糖尿病中医病机，遵循祛瘀益气养阴法拟定的纯中药复方制剂。因此，本实验通过糖尿病大鼠的研究探讨芪蛭降糖片是否对糖尿病胰岛损伤有保护作用，并利用网络药理学探索其对胰岛损伤的保护机制。

1 实验材料

1.1 药品

芪蛭降糖片(购自广东合威制药有限公司，批号：180102)；格列本脲片(购自天津力生制药股份有限公司，批号：1712065)；盐酸二甲双胍片(购自上海华氏制药有限公司，批号：AAu/4623)。

1.2 试剂

鱼跃血糖试纸(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司，批号：1704532)；链脲佐菌素(北京普博斯生物科技有限公司，批号：615K0321)；糖化血清蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：K187413H)；诱导型一氧化氮合酶试剂盒(上海抚生实业有限公司，批号：AK16305)；胰岛素试剂盒(武汉默沙克生物科技有限公司，批号：E02I0004)。

1.3 实验动物

SPF级Wistar大鼠200只，体质量150±20 g，雌雄各半，河南省医学实验动物中心提供。

1.4 实验仪器

三诺血糖测试仪(亿家康诚医疗器械专营店，型号：HEA-232)；高速冷冻离心机(山东梁嘉机械设备有限公司，型号：XPN-80)；酶标仪(济南来宝医疗器械有限公司，型号：HBS-1096A)。

2 方法

2.1 糖尿病模型建立

在Wistar大鼠在禁食12 h后,采用链脲佐菌素尾静脉注射60 mg/kg建立大鼠糖尿病模型。72 h 后采用血糖仪试纸法检测血糖值，其中空腹血糖值≥15 mmol/L大鼠作为实验鼠。

2.2 分组与治疗

实验分为5组，每组18只，雌雄各半。每组给药剂量按每日成人最大给药剂量换算。芪蛭降糖片组(每日灌胃芪蛭降糖片混悬液780 mg/kg)；盐酸二甲双胍片组(每日灌胃盐酸二甲双胍片混悬液200 mg/kg)；格列本脲片组(每日灌胃格列本脲片混悬液1.5 mg/kg)；模型组和正常组作为对照。连续给药3 mon。

2.3 治疗评价

观察每组大鼠的一般状况，如毛色、生理状态、活动频率等。每周称量各组大鼠体重及检测各组大鼠24 h排尿量、饮食量、饮水量。治疗后第20天、第50天、第90天测空腹血糖值；眼眶静脉丛采血，静止离心分离血清，按照试剂盒说明书检测血清INS、 GSP及iNOS。3 mon后处理大鼠，取胰腺多聚甲醛固定，按本课题组以前的方法[7]进行HE染色，评价胰腺损伤情况。

2.4 芪蛭降糖片活性成分筛选及靶点预测

通过研究发现，芪蛭降糖片由黄芪、黄精、地黄和水蛭组成。以“黄芪”“黄精”“地黄”为关键词在传统中药系统药理学数据库和分析平台 TCMSP中查找其主要化学成分，通过评价成分的体内过程，用口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18 筛选黄芪、黄精、地黄的活性成分。通过文献检索得到水蛭中的化学成分[8]。将芪蛭降糖片中筛选得到的活性成分作为关键词在 Pubchem 数据库中进行检索, 下载 SDF 格式有效成分的 3D 结构, 再将各活性成分的 3D 结构式提交到 PharmMapper 数据库中进行芪蛭降糖片靶点预测。

2.5 筛选芪蛭降糖片对胰岛损伤相关治疗靶点

采用TTD和DrugBank 数据库以“diabetes”为关键词收集与糖尿病及其并发症有关的疾病靶点。为明确糖尿病相关靶点与药物芪蛭降糖片潜在靶点之间的相互作用关系，将糖尿病明确疾病靶点与芪蛭降糖片靶点输入 Venny 2.1韦恩图在线绘制工具取交集绘制。筛选出与芪蛭降糖片治疗糖尿病胰岛损伤作用明确相关的治疗靶点。

2.6 富集生物过程和KEGG通路分析

将筛选出的糖尿病治疗靶点导入生物学信息注释 DAVID 数据库进行GO富集生物过程和KEGG通路富集分析，以P<0.05，count>4筛选出对应相关的生物过程和信号通路。

2.7 统计方法

3 结果

3.1 芪蛭降糖片对糖尿病大鼠一般症状的影响

多饮、多食、多尿、体重减轻是糖尿病的典型症状，模型组上述症状表现很明显并且出现腹部膨大现象。采用芪蛭降糖片、盐酸二甲双胍片和格列本脲片进行治疗后上述症状较模型组有所改善，但两种常用西药对腹部膨大改善不明显，而芪蛭降糖片可以减小腹部膨大，具有较好的疗效。见表1、表2、表3。

表1 大鼠饮水量和食量

表2 大鼠尿量和体重

表3 大鼠腹围

3.2 芪蛭降糖片对糖尿病大鼠血糖和血清INS、GSP及iNOS的影响

模型组大鼠血糖升高，血清INS降低，GSP和iNOS增高。与模型组相比，给药组能够降低糖尿病大鼠的高血糖。芪蛭降糖片降糖作用虽不及盐酸二甲双胍片和格列本脲片起效快，但能明显改善低胰岛素和高GSP及iNOS状态，见表4。

表4 大鼠血清GSP及iNOS

3.3 芪蛭降糖片对糖尿病大鼠胰腺的保护作用

对各组大鼠胰腺切片HE染色发现：模型组大鼠胰岛细胞数目减少，细胞水肿变形，表现出胰腺组织损伤明显；盐酸二甲双胍片组和格列本脲片组胰腺组织损伤改善不明显；芪蛭降糖片组可见胰腺组织损伤明显改善。见图1。

图1 胰腺组织病理变化

3.4 芪蛭降糖片活性成分及作用靶点

通过TCMSP数据库及文献查找OB≥30%和DL≥0.18筛选芪蛭降糖片18个主要活性成分及521个作用靶点。通过与TTD和DrugBank 数据库糖尿病相关治疗靶点比对分析得到30个芪蛭降糖片治疗糖尿病胰岛损伤作用明确相关的治疗靶点。采用 Cytoscape 3．2．1 软件绘制芪蛭降糖片靶点—成分网络图，见图2。

3.5 芪蛭降糖片富集生物过程和通路分析

通过DAVID 数据库将上述30个靶点进行GO富集生物过程和KEGG通路富集分析，得到20个生物过程和17条相关通路。其中生物过程涉及“炎症反应”“调节胰岛素分泌” “一氧化氮生物合成过程的正调节”“细胞增殖的调节”等，见表6。 KEGG信号通路涉及“PI3K-Akt信号通路”“胰岛素信号通路”“胰岛素抵抗”“Jak-STAT信号通路”等，见表7。

图2 芪蛭降糖片活性成分-作用靶点图

表6 GO富集分析

表7 KEGG通路分析

4 讨论

糖尿病是一种机体机能紊乱性疾病，其典型特征为慢性持续性的血糖增高、糖耐量异常以及尿糖阳性。糖尿病属于中医“消渴”范畴，主要病机为气阴两亏、燥热内盛[9-10]。芪蛭降糖片由黄芪、水蛭、地黄和黄精组成，其中黄芪为补气之最，地黄和黄精长于滋阴清热，水蛭最擅消除气阴两亏和燥热内盛引起的血瘀，四者合用发挥着治疗糖尿病的作用。在本研究过程中，糖尿病模型组大鼠出现高血糖及“三多一少”症状。常用口服降糖药与芪蛭降糖片均能降低血糖，改善症状，但其速度和机制却不同。

胰岛β细胞分泌胰岛素或胰岛素在机体内的利用过程发生障碍是糖尿病患者血糖增高的主要原因。因此，以往糖尿病的治疗总是以补充胰岛素、促进胰岛素分泌和提高胰岛素的敏感性为主。在糖尿病患者中胰岛炎症损伤引起广泛的关注，越来越多的人开始关注促进胰岛损伤修复作为治疗糖尿病的新途径。本研究建立的糖尿病模型大鼠血清GSP及iNOS增高，提示存在持续炎症损伤。病理切片显示，胰腺组织损伤明显。血清INS持续降低证实了胰岛损害。与常用口服降糖药相比，芪蛭降糖片虽降糖速度较慢，但能修复胰岛损伤，有阻止胰岛细胞纤维化、炎症和凋亡作用。并且可以降低血清GSP及iNOS含量。

网络药理学是通过系统方法分析药物对生物网络的作用和影响，从整体角度认识和预测药物靶点的方法，适用于解释中药单复方复杂成分的作用机制[11-13]。本研究采用网络药理学方法,通过分析芪蛭降糖片的主要活性成分和治疗糖尿病胰岛损伤的相关靶点，并预测了相关生物过程和信号通路，阐明芪蛭降糖片保护糖尿病胰岛损伤的作用机制。在本研究中发现了芪蛭降糖片保护糖尿病胰岛损伤涉及生物过程20个，富集在17条信号通路上。生物过程涉及炎症反应、调节胰岛素分泌、 细胞增殖的调节等。这些表明上述的生物过程在糖尿病发病中起重要作用。KEGG信号通路涉及PI3K-Akt信号通路、Jak-STAT信号通路、胰岛素抵抗、胰岛素信号通路等。研究表明[14]PI3K-AKT 信号通路可以调控相关因子蛋白的表达，激活胰腺 PI3K-AKT 信号通路，减轻胰岛素抵抗和胰岛β细胞的损伤从而保护胰岛β细胞，从而改善胰岛素抵抗，降低血糖。因此PI3K-AKT 信号通路对胰岛 β细胞分泌胰岛素具有重要作用。然而其他方面芪蛭降糖片的生物过程和信号通路需要进一步探索研究。

综上所述，相较于常用西药，芪蛭降糖片通过多途径、多靶点参与促进胰腺损伤修复，长期服用有促进胰岛功能恢复正常作用，可用于防治糖尿病及相关血管并发症。