卡泊三醇对TNF-α诱导的人角质形成细胞中CCL20表达的影响

王岚琦 杨梦波 王孝盼 鞠 强

1上海交通大学医学院附属仁济医院皮肤科，上海，200127；2上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科，上海，200025

CCL20是CC亚族的趋化因子，曾被称为“巨噬细胞炎症蛋白3α”(macrophage inflammation protein 3α, MIP3α)。人体内的多种组织和细胞均可表达CCL20，正常人皮肤中，角质形成细胞(keratinocyte, KC)极少量地组成性表达CCL20。CCL20具有招募表达其特异性配体CCR6的细胞聚集在上皮组织的作用。不成熟的树突状细胞和外周血中Th17细胞表面表达CCR6，被CCL20招募聚集至皮肤中发挥作用[1]。银屑病患者的皮损中，CCL20有免疫监视功能，其高表达时显示过强的“免疫监视”和皮肤屏障的破坏，并且与病情成平行关系。银屑病皮损处高表达的白介素(interleukin, IL)1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)、IL-17均强有力地刺激CCL20的表达[2]。卡泊三醇是维生素D衍生物，具有调节T细胞分化[3]和巨噬细胞活化的作用[4]，参与调节免疫反应。目前已知卡泊三醇可以调节银屑病患者外周血和皮损处Th17细胞迁移[5]，但卡泊三醇调节KC中CCL20表达的相关性研究报道仍较少。为此，我们探讨卡泊三醇对于KC中CCL20的表达及下游相关信号通路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 重组人TNF-α蛋白, CCL20酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自R&D公司；PBS，DMEM培养基，胰酶，胎牛血清，无血清培养基(美国Gibco公司)；Trizol RNA提取试剂(美国Invitrogen公司)，反转录酶试剂盒(日本TaKaRa公司)，实时荧光定量PCR试剂盒(美国BioRad公司)；卡泊三醇，SB202190, SP600125, U0126, CAPE(美国Sigma公司)。兔抗人p-p38, p38，p-ERK, ERK，p-p65, p65, β-tubulin一抗(美国CST公司)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(美国CST公司)，BCA蛋白分析试剂盒(美国Thermo公司)，化学发光试剂盒(美国BioRad公司)。

1.2 细胞培养 人原代角质形成细胞由上海交通大学免疫所李宁丽教授惠赠，5～9代细胞用于实验。无血清培养基培养人原代角质形成细胞，添加5%牛下丘脑提取物，5 ng/mL人重组表皮生长因子。细胞置于37℃、5%CO2培养箱中，每两天更换1次培养液。待培养皿中细胞覆盖皿底70%～80%融合时，用胰酶消化传代。

1.3 细胞刺激 角质形成细胞接种于12孔板(1×105细胞/孔)。待细胞长至70%～80%融合，分别应用TNF-α(10 ng/mL)，卡泊三醇(10/100/1000 nM)，TNF-α+卡泊三醇，TNF-α+卡泊三醇+SB202190(1 μM)，TNF-α+卡泊三醇+SP600125(1 μM)，TNF-α+卡泊三醇+U0126(1 μM)，TNF-α+卡泊三醇+CAPE(1 μM)刺激。SB202190, SP600125, U0126，CAPE预刺激1 h后加入卡泊三醇刺激1 h，随后加入TNF-α。DMSO作为对照组。

1.4 实时荧光定量PCR检测细胞中CCL20mRNA水平 TRIzol提取人原代角质形成细胞中RNA，使用TaKaRa试剂盒按照说明书逆转录获得cDNA，检测基因及引物序列见表1，GAPDH作为内参。

表1 实时荧光定量PCR检测基因及引物序列(5’-3’)

1.5 ELISA检测细胞培养上清液中CCL20分泌量 将原代人角质形成细胞接种于96孔板中(2×104/孔)，刺激同上，24 h后收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作检测，并设定空白对照孔，酶标仪检测450 nm处吸光度。根据标准曲线计算样本浓度。

1.6 Western印迹检测细胞中p38，ERK，NF-κBp65磷酸化水平 将人角质形成细胞接种于12孔板中(2.5×105个/孔)，24 h后待细胞融合度达到80%以上时，卡泊三醇1000 nM预刺激1 h，随后给予10 ng/mL TNF-α刺激，继续培养15/30/60 min后，RIPA裂解液提取总蛋白，刮下细胞并转移至1.5 mL微量离心管中，冰上裂解30 min，使蛋白充分裂解，10000 g离心5 min，吸取上清液留存，弃沉淀。BCA试剂盒测定蛋白浓度，调整蛋白浓度，加入5×十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白上样缓冲液，煮沸变性。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将分离后的蛋白转至聚偏二氟乙烯膜上，封闭液封闭1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入兔抗人p-p38、p-ERK、p-p65、p38、ERK、p65一抗，4℃孵育过夜，加人羊抗兔二抗室温孵育1 h，化学发光系统ECL试剂盒显影成像。

1.7 统计学方法 采用SPSS 23软件分析数据，结果以均数±标准差表示，每个实验重复3次，3组间指标的比较采用单因素方差分析，并采用LSD校正进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。采用Graphpad软件制图。

2 结果

2.1 卡泊三醇抑制TNF-α诱导KCs中CCL20的表达 同TNF-α 组相比，卡泊三醇(100 nM)抑制CCL20mRNA表达(P<0.001)，见图1a，卡泊三醇刺激细胞3 h或6 h后，细胞中CCL20mRNA表达量下降。卡泊三醇抑制CCL20的蛋白表达，并且呈剂量相关(P<0.001)，见图1b。

1a：卡泊三醇(100 nM)预刺激人原代角质形成细胞1 h，随后给予TNF-α(10 ng/mL)刺激人原代角质形成细胞3 h，Q-PCR检测CCL20mRNA的表达；1b：卡泊三醇(10/100/1000 nM)预刺激人原代角质形成细胞1 h，随后给予TNF-α(10 ng/mL)刺激人原代角质形成细胞24小时，ELISA检测CCL20蛋白的表达。*：P<0.1,**：P<0.01,***：P<0.001，NS：no significance

2.2 MAPKs和NF-κB通路参与TNF-α 诱导CCL20的表达 使用MAKPs和NF-κB通路抑制剂(p38抑制剂：SB202190；JNK抑制剂：SP600125；ERK抑制剂：U0126；NF-κB抑制剂：CAPE)预刺激KCs，观察TNF-α 刺激后CCL20 mRNA表达。同对照组相比，CCL20 mRNA的表达在p38抑制剂组(P=0.003)和NF-κB抑制剂组下降(P=0.006)。ERK抑制剂作用后，CCL20 mRNA的表达增加(P=0.009)。JNK抑制剂作用后CCL20 mRNA的表达变化无统计学差异(P=0.102)，见图2a。在TNF-α 刺激15 min后，p38、ERK、NF-κBp65磷酸化加强(图2b)。

NS：no significance;SB：SB202190;SP：SP600125 ns：not significant;con：空白对照;SB：SB202190;SP：SP600125;Cal：卡泊三醇

2.3 MAPKs参与卡泊三醇抑制TNF-α诱导CCL20 卡泊三醇抑制了TNF-α诱导的KC中p38、ERK、NF-κBp65磷酸化(图3a)。MAPKs和NF-κB抑制剂预刺激后，使用TNF-α(10 ng/mL)和卡泊三醇(1000 nM)共刺激KC，CCL20表达在p38抑制剂组下降(P=0.048)，而ERK抑制剂促进CCL20表达(P=0.002)。JNK和NF-κB抑制剂对于卡泊三醇和TNF-α共刺激组的CCL20表达无影响(JNK抑制剂组，P=0.206；NF-κB抑制剂组，P=0.290)，见图3b。

3 讨论

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，其发病率在高加索人群为2%。银屑病主要病理表现为角质形成细胞(keratinocyte，KC)增生，角化不全，真皮内炎症细胞浸润[6]。目前银屑病的发病机制还没有定论，但越来越多的研究表明皮肤屏障功能受损[6]及白介素(IL)-23/Th17轴和Th17相关的细胞因子在疾病的发生、发展中起关键作用[7，8]。银屑病患者KC高表达病原体识别受体(pattern recognition receptors, PRR)，外界病原相关分子模式通过PRR活化天然免疫系统，诱发皮肤炎症[9，10]。同时坏死的KC释放的损伤相关分子活化天然免疫系统，促进皮肤炎症[11]。皮肤屏障破坏后外界有害刺激和皮肤共生菌直接进入真皮被树突状细胞识别，递呈细菌抗原，活化适应性免疫系统，招募免疫细胞聚集在皮肤，诱发炎症[12]。同正常人相比，银屑病患者皮损中Th17细胞，γδ T细胞数量显著增多，这些细胞在患者的外周血中却少于正常对照者[13，14]，提示这些产生IL-17的细胞在疾病过程中存在着重新分布，即从外周游向皮肤。Th17细胞，γδ T细胞通过表面表达的趋化因子受体CCR6靶向皮肤迁移聚集[13，14]。CCL20是CCR6在体内的唯一配体，其在皮肤中主要来源于KC[1]。Th17细胞，γδ T细胞活化后分泌下游效应分子，如IL-17A、IL-17F、IL-22和TNF-α[13，15]。其中TNF-α调节皮肤抗菌肽(包括β-防御素和S100A家族)的表达[16]，下调filaggrin和黏附分子表达，导致皮肤屏障破坏[17]。TNF-α促进促炎因子(IL-6，IL-1β)和趋化因子(CXCL8，CCL20)在皮肤中的表达，引起局部炎症反应[1，18]。FDA批准了TNF-α单克隆抗体用于治疗中度至重度银屑病。多中心研究显示TNF-α单克隆抗体可以有效改善患者生活质量及症状[19]。

卡泊三醇是维生素D衍生物，能够诱导角质细胞的分化、抑制其增殖、调节免疫功能并减轻炎症，是治疗银屑病的一线药物。卡泊三醇可以调节T细胞迁移[20]，银屑病患者使用卡泊三醇治疗后皮损中Th17数量下降[5]。卡泊三醇对于炎症的调节在不同细胞中呈现不同结果。有研究显示骨化三醇抑制类风湿滑膜成纤维细胞中TNF-α诱导的CCL20的表达。而在关节软骨细胞中，骨化三醇加强了TNF-α诱导的CCL20的表达[21]。而在人角质形成细胞中，我们的研究显示卡泊三醇抑制TNF-α诱导的CCL20表达，这可以解释银屑病患者接受卡泊三醇治疗后皮损中Th17和γδ T细胞数量下降[5]。

MAPKs和NF-κB是炎症反应相关的重要信号通路。在不同表皮细胞系中，TNF-α可以活化MAPKs和NF-κB通路。在呼吸道上皮中，TNF-α通过p38和ERK通路促进CCL20的产生[22]；在肠道上皮中，TNF-α通过p38途径促进CCL20的表达[23]。我们的研究显示TNF-α诱导人KCs中ERK，p38，NF-κBp65的磷酸化，参与CCL20的表达，而JNK通路在其中不起作用。有趣的是，不同于寻常MAPKs活化促进炎症反应，我们研究显示使用ERK抑制剂后，CCL20的表达进一步上升，表明ERK的活化抑制CCL20的表达。在卡泊三醇抑制TNF-α诱导的CCL20过程中，NF-κB、ERK、p38MAPK均参与此过程。卡泊三醇通过抑制NF-κB p65，p38MAPK磷酸化，抑制CCL20的表达。在图3b中显示NF-κB和JNK抑制剂对于卡泊三醇和TNF-α共刺激组的CCL20表达无影响，我们认为这两组的发生机制有所不同。我们的研究结果显示NF-κB参与TNF-α诱导CCL20产生的过程(图2b)，卡泊三醇抑制NF-κB p65亚单位的磷酸化(图3a)，因此再加入NF-κB抑制剂不会影响卡泊三醇和TNF-α共刺激组的CCL20表达，这说明NF-κB是卡泊三醇的下游信号通路。而JNK不参与TNF-a诱导CCL20产生的过程，因此使用了JNK抑制剂后，下游CCL20的表达量无改变。综上所述，我们发现TNF-α促进KCs产生趋化因子CCL20，而卡泊三醇能够显著抑制CCL20表达，NF-κB, ERK，p38MAPK参与此过程。