即刻早期基因Cyr61在宫颈癌中的表达及与高危型HPV感染的关系

李 晖

(广州军区广州总医院附属一五七医院，广东 广州 510510)

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病与分娩次数、家族遗传、高危型人乳头瘤病毒(High-risk type of human papillomavirus，HPV)持续感染等因素密切相关，其中，高危型HPV持续感染是最主要的诱因[1-2].相关研究[3]显示：超过90%的宫颈癌患者体内可检测出高危型HPV阳性，其中HPV16所占比例最高，40%～60%的宫颈癌患者HPV16呈阳性.即刻早期基因Cyr61是小鼠成纤维细胞经血小板源生长因子刺激后生成的一种富含半胱氨酸的分泌型蛋白，当受到细胞因子、紫外照射、缺氧等因素刺激后，能够短暂性表达、介导细胞的增殖、分化、凋亡等过程[4].相关研究[5-6]显示：在胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌等多种人体恶性肿瘤中均存在Cyr61的异常表达.本研究检测了不同宫颈病变组织及HPV阴性的人宫颈癌细胞、HPV16阳性的人宫颈癌细胞株中Cyr61的表达情况，并探讨宫颈癌与高危型HPV感染的关系.

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2018年1月—2019年6月在广州军区广州总医院附属一五七医院行宫颈病变手术的患者183例，术后均留存宫颈病变组织的石蜡包块，术前均无放化疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗史.根据术后病理检查结果分为良性病变组39例，宫颈上皮内瘤变组69例，宫颈癌组75例.宫颈良性病变组患者年龄45～76岁，平均(53.61±6.35)岁.宫颈上皮内瘤变组患者年龄47～73岁，平均(54.28±6.90)岁；临床分级Ⅰ级27例，Ⅱ级24例，Ⅲ级18例.宫颈癌组患者年龄48～75岁，平均(54.84±5.81)岁；FIGO病理分期Ⅰ期24例，Ⅱ期30例，Ⅲ期15例，Ⅳ期6例.本研究经医院医学伦理委员会批准，患者自愿参与并签署知情同意书.

1.2 材料与试剂

HPV阴性的人宫颈癌细胞株C33a、HPV16阳性的人宫颈癌细胞株Caski(上海弘顺生物科技有限公司)；Cyr61免疫组化试剂盒、总RNA提取试剂盒(上海甄准生物科技有限公司)；鼠抗人Cyr61单克隆抗体、鼠抗人E6单克隆抗体、山羊抗鼠IgG(北京百奥莱博科技有限公司)；HPV16 E6特异性抑制序列siRNA和阴性对照序列(上海信裕生物科技有限公司设计合成).

1.3 方 法

1.3.1 免疫组化检测

取宫颈病变组织，4 μm切片，60 ℃烤片、脱蜡、梯度酒精脱水后高温修复抗原，静置冷却至室温，以阻断内源性过氧化物酶活性.滴加鼠抗人Cyr61单克隆抗体(1∶200稀释)，4 ℃孵育过夜，滴加山羊抗鼠IgG(1∶1 000稀释)，静置2 h，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片.倒置显微镜下随机选取5个视野，观察染色强度和阳性细胞比例.染色强度评分：阴性、阳性、强阳性依次赋0分、1分、2分；阳性细胞比例评分：<5%、5%～75%、>75%依次赋0分、1分、2分；以染色强度与阳性细胞百分比的乘积判断Cyr61表达水平，0分为阴性，1～2分为阳性，4分为强阳性.

1.3.2 RT-PCR检测

应用Triozl法提取宫颈癌细胞总RNA，反转录为cDNA、Cyr61、GAPDH(引物由上海启因生物科技有限公司合成)，Cyr61上游引物5′-CCTTTTGG GACCGCAAT GG-3′，下游引物5′-CCAGTATCGA CAAAGGACG-3′；GAPDH上游引物5′-GG GATAT CACTCAGCATAAT-3′，下游引物5′-GAAATCACTC CCAATTAATC-3′.反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 2 min，56 ℃ 40 s，共40个循环，72 ℃延伸2 min.记录Cyr61和GAPDH扩增条带的灰度值，并计算二者比值，以比值作为Cyr61 mRNA的相对表达量.

1.3.3 Western blot检测

应用RIPA裂解液提取宫颈癌细胞全蛋白，4 ℃ 12 000 r/min离心收集上清，BCA测定蛋白含量，行SDS-PAGE凝胶电泳，分离目标蛋白，转膜至PVDF，5%脱脂奶粉封闭2 h；滴加鼠抗人Cyr61单克隆抗体(1∶200稀释)、鼠抗人GAPDH单克隆抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜；滴加HRP标记的鼠抗人IgG(1∶2 000稀释)，室温静置2 h，ECL显色，在暗室中显影，采集图像并分析各条带灰度值，计算Cyr61和GAPDH条带灰度值，两者的比值为Cyr61蛋白的相对表达量.

1.3.4 沉默Caski细胞E6表达对Cyr61mRNA和蛋白表达的影响

应用HPV16 E6特异性抑制siRNA序列转染人宫颈Caski细胞，转染后分为siRNA组、阴性对照组及空白对照组(正常培养的人宫颈Caski细胞)，每组设5个复孔.培养72 h后，提取细胞总RNA，反转录为cDNA、E6(引物由上海启因生物科技有限公司合成)，E6上游引物5′-GTGGTTTGCA CCGAACGGTCGGG-3′，下游引物5′-GGAGACTGT GTACGTCGAGGGCC-3′；Cyr61引物序列和反应条件同上.培养72 h后，提取细胞总蛋白，离心收集上清，定量后电泳分离目标蛋白，转膜后封闭2 h，滴加鼠抗人E6单克隆抗体(1∶300稀释)、鼠抗人Cyr61单克隆抗体(1∶200稀释)、鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜，滴加HRP标记的鼠抗人IgG(1∶2 000稀释)，室温静置2 h，ECL显色，在暗室中显影，采集图像并分析各条带灰度值.

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 不同宫颈组织中Cyr61的表达水平

宫颈癌组Cyr61阳性率明显低于良性病变组和宫颈上皮内瘤变组，宫颈上皮内瘤变组Cyr61阳性率明显低于良性病变组，差异具有统计学意义(P<0.01).见表1.

表1 不同宫颈组织中Cyr61表达水平

2.2 不同病理特征的宫颈癌患者Cyr61阳性率

不同分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况的宫颈癌患者中Cyr61阳性率之间差异具有统计学意义(P<0.05)；其中分化程度G1～G2、无宫旁浸润、有淋巴结转移的宫颈癌患者Cyr61阳性率偏高.不同病理类型、FIGO分期的宫颈癌患者中Cyr61阳性率差异无统计学意义(P>0.05).见表2.

表2 不同病理特征的宫颈癌患者Cyr61阳性率

2.3 宫颈癌细胞中Cyr61 mRNA和蛋白的表达水平

宫颈癌细胞株C33a的Cyr61 mRNA和蛋白表达水平明显高于宫颈癌细胞株Caski的表达水平，差异具有统计学意义(P<0.01).见表3、图1.

表3 宫颈癌细胞中Cyr61 mRNA和蛋白的表达水平

2.4 沉默E6表达对Caski细胞Cyr61mRNA和蛋白表达的影响

siRNA组Caski细胞中E6 mRNA和蛋白表达水平明显低于空白对照组和阴性对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；siRNA组Caski细胞中Cyr61mRNA和蛋白表达水平明显高于空白对照组和阴性对照组，差异具有统计学意义(P<0.05).空白对照组与阴性对照组E6、Cyr61 mRNA和蛋白表达水平之间差异无统计学意义(P>0.05).见图2～3、表4.

表4 各组Caski细胞中E6、Cyr61 mRNA和蛋白表达水平

3 讨 论

我国每年新发宫颈癌患者约占全球新发患者的35%[7]，HPV16、HPV18等高危型HPV长期感染是宫颈癌发病的主要原因，其中HPV16是我国女性最常见的高危型HPV，且不同程度的宫颈病变中HPV16所占比例存在差异[8-9].在HPV16刺激和干扰宿主细胞基因组时会诱发癌蛋白E6高表达，激活多个信号通路导致细胞周期紊乱，增强宿主基因组的稳定性，细胞凋亡率降低，引发组织细胞异常增生[10].Cyr61在人体多个组织器官中均有分布，在胃癌、肝癌等恶性肿瘤中发挥抑癌基因的作用，在肺癌、前列腺癌等恶性肿瘤中发挥促癌基因的作用[11].本研究显示：宫颈良性病组中Cyr61表达水平最高，其次为宫颈上皮内瘤变组，宫颈癌组Cyr61表达水平最低；且Cyr61阳性表达与分化程度、浸润深度、淋巴结转移明显相关.提示Cyr61低表达可能介导宫颈癌的发生与发展，作为抑癌因子在宫颈癌中发挥作用，临床中可将Cyr61作为生物学标志物用于监测宫颈癌的发展.

研究[12-13]发现：在正常细胞向肿瘤细胞转化过程中，HPV16 E6蛋白与p53发挥重要的生物学作用.Cyr61基因的启动子区域包含p53结合位点，相关研究[14]显示：p53调节Cyr61表达的敏感性较佳，能够影响癌细胞的增殖、迁移与侵袭.本研究显示：HPV16阳性的宫颈癌细胞株Caski中Cyr61 mRNA和蛋白的表达水平明显低于HPV阴性的宫颈癌株C33a.使用HPV16 E6特异性抑制序列siRNA沉默Caski中E6的表达后，Cyr61 mRNA和蛋白表达水平明显提升，提示宫颈癌Caski表达与高危型HPV16感染明显相关，高危型HPV16可能通过相关信号通路下调了Caski表达，促进宫颈癌的发生与发展.研究[15]发现：Erk、AKT等多种因子参与HPV所致的宫颈癌发生过程，但相关信号通路目前仍未完全明确.本研究结论提示：Cyr61表达下调可能是HPV16诱发宫颈癌的新的信号通路，应用特异性沉默E6增强Cyr61的活性有望成为宫颈癌治疗的新途径.