BACs-on-Beads技术对微缺失/微重复综合征的产前诊断

李春艳 郑 娇 燕 凤 程 璐 宋婷婷 陈必良 徐慧 张建芳

空军军医大学第一附属医院(西安,710032)

传统染色体核型分析是染色体疾病诊断的“金标准”[1],但培养周期长、易培养失败,对5Mb以下的染色体缺失/重复无法正确检出。BACs-on-Beads(BoBs)技术是一种快速产前诊断技术,将DNA探针固定在经过荧光编码的Luminex微球表面,采用微球阵列分析同时检测5种染色体非整倍体(13、18、21、X和Y)及常见的微缺失综合征(Wolf-Hirschhorn综合征、Cri du Chat综合征、Williams-Beuren综合征、Langer-Giedion综合征、Prader-Willi/Angelman综合征、Miller-Dieker综合征、Smith-Magenis综合征及DiGeorge综合征),大大缩短了检测时间,提高了产前诊断效率。本文对4639份羊水进行BoBs快速检测,探讨其在检测微缺失/微重复综合征中的应用价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料

2015年1月－2018年3月来本院产前诊断中心接受遗传咨询并进行羊水穿刺的孕妇4639例,年龄(28.3±4.0)岁,孕周(20.3±2.5)周。孕妇的产前诊断指征包括：高龄(≥35岁)；血清学筛查高风险；超声异常；无创DNA产前检测(NIPT)高风险；不良孕产史；其他(家族遗传病史、夫妻一方染色体异常、不良接触史等)。所有孕妇均签署产前诊断知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1羊膜腔穿刺 超声定位及引导下行羊膜腔穿刺,抽取羊水30ml,15ml用于核型分析,10ml用于BoBs检测,5ml用于荧光原位杂交技术(FISH)检测。

1.2.2染色体核型分析 15ml羊水无菌操作下进行培养,常规染色体制片、G显带,每例样本分析30个分裂相,采集3～5个核型图。发现染色体异常或多态性时,适当增加分析的核型数。

1.2.3 BoBs检测 采用DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)提取样本DNA。Prenatal BoBs TM试剂盒(PerkinElmer公司)进行样本检测,Luminex 200TM读取信号强度,BoBsoft 2.0软件进行结果分析。

1.2.4荧光原位杂交技术(FISH) 羊水行细胞处理、玻片处理、杂交、洗片、复染后于荧光显微镜下观察。每例样本随机计数50个细胞,发现染色体异常时,扩大计数至100个细胞。

1.2.5染色体芯片分析(CMA) 采用CytoScan 750K Array(Affymetrix公司)检测基因组DNA拷贝数变化(CNV)、单亲二倍体及杂合性缺失,Ch AS软件进行结果分析。

2 结果

4639份羊水中BoBs共检出微缺失/微重复20例(0.43%)。见表1。22q11.2缺失和重复综合征进行FISH验证,其余综合征进行染色体核型分析和CMA验证,结果均与BoBs一致。

表1 20例微缺失/微重复综合征的检测结果

染色体核型分析只检出缺失/重复3例,且其缺失/重复的区域均大于15Mb,如病例8,核型结果为46,XX,del(4)(p15.3),BoBs结果显示4p16.3缺失,为Wolf-Hirschhorn综合征,CMA结果发现4p 16.3 p15.32(68,345_15,712,119)区域缺失15.6Mb。病例13,核型结果为46,XX,del(5)t(4；5)(q28.3；p14.1),BoBs结果发现5p15.3-p15.2缺失,为Cri du Chat综合征,CMA验证发现4q28.3q35.2(131,452,554_190,957,473)区域重复59.5Mb,同时5p15.33p14.1(113,576_26,634,417)区域缺失26.5Mb,即猫叫综合征,缺失区域包含50个OMIM基因。病例20,核型结果发现标记染色体存在,不确定其来源,BoBs结果显示18p11.32p11.21重复,CMA结果发现18p11.32p11.21(136,226_15,143,714)区域重复15Mb,为18p四体综合征,电话随访得知,孕妇被告知染色体核型分析、BoBs和CMA检测结果均异常并进行遗传咨询后,均选择终止妊娠。

病例19,孕妇因血清学筛查21三体高风险行羊水穿刺,BoBs检测发现Xp22.31缺失,CMA验证得 到Xp22.31(6,455,151_8,141,076)x1：1.69Mb,该缺失区域包括HDHD1、STS、VCX、PNPLA4、VCX2等OMIM基因,STS为遗传性鱼鳞病相关基因,患者可能有发育迟缓、鱼鳞病、认知能力差等临床表现,但该缺失区域具有不完全外显率,临床表现不完全一致,随后对孕妇进行CMA检测,结果完全一致,其决定继续妊娠。病例6,7,17,孕妇得知检测结果并进行遗传咨询后,均决定继续妊娠。

相较于染色体核型分析,BoBs技术的检出率增加了0.37%(17/4639),如22q11.2微重复综合征(病例1,3,12),Smith-Magenis综合征(病例2),Di-George综合征(病例4,5),Potocki-Lupski综合征(病例10),Williams-Beuren综合征(病例11,15,16)等。

3 讨论

目前,染色体核型分析是染色体疾病诊断的“金标准”,但培养周期长、对技术人员要求高、易培养失败,导致无法正常时间发放报告,增加了孕妇的紧张和焦虑情绪。随着分子细胞遗传学技术的发展,BoBs、FISH、CMA,多重连接依赖探针扩增技术(MLPA),荧光定量PCR(QF-PCR)等不断应用于临床,提高了产前诊断的效率及准确性[2-3]。

本研究利用BoBs技术联合染色体核型分析对4639份羊水进行快速检测,检出微缺失综合征13例,微重复综合征7例,检出率为0.43%。产前BoBs结果与FISH、CMA等检测结果一致,体现了该技术的准确性及在临床应用的可靠性。染色体核型分析只检出3例微缺失/微重复(缺失/重复区域均大于15Mb),联合BoBs增加了0.37%的检出率,避免了单纯染色体核型分析的假阴性结果。本研究中微缺失/微重复的检出率较国内外报道降低[4-5],可能与微缺失/微重复综合征本身的发病率较低,且样本量不够大有关。

FISH技术主要用于检测13、18、21、X和Y染色体非整倍体,对某些特定区域检测需定制相应的探针,耗时耗力,BoBs技术针对9种常见微缺失区域设置4～8个探针(9种微缺失综合征总发生率约为1/1700[6]),提高了检测的范围及效率[7]。近年来,CMA技术被推荐为胎儿超声结构异常检测的首要手段,同时广泛应用于先天性心脏病、神经发育异常、智力障碍等临床评价[8-9],但CMA检测价格昂贵,会产生很多意义不明确的结果(VOUS),增加了遗传咨询的难度。BoBs技术快速、经济、灵敏、高通量,不需要进行羊水细胞培养,实验成功率高,结果明确,易于解读,是核型分析的有力补充。

Choy等[10]对2153例样本行染色体核型分析、QF-PCR及BoBs检测结果显示BoBs技术能准确检出所有的染色体非整倍体,同时对微缺失综合征的检出能力明显优于染色体核型分析及QF-PCR,敏感性为96.7%,特异性为100%。郭克建等[11]通过对921例羊水进行快速诊断发现,BoBs联合核型分析的异常检出率为6.84%,比单一体核型分析提高了16.7%,是一种可选择的稳定准确的新技术。但是BoBs对点突变、平衡性重排、倍性变化、单亲二倍体、甲基化改变及低比例嵌合(＜20%)等无法正确检出[6],此外母血污染也会影响结果的判读,因此遇到阳性结果时,需结合染色体核型分析、FISH、CMA等技术共同判断[12-13]。临床医生应在检测前告知孕妇每种技术的优缺点并根据产前诊断指征进行恰当的的遗传咨询。

综上所述,BoBs技术联合核型分析的检测模式在提高染色体异常检出率的同时减少了患者的等待时间,适合大量产前诊断样本的快速处理,值得在临床中应用。