基于HSP70下调表达的凋亡素衍生肽抑制GBM侵袭与生长的实验研究

文 程，王 薇

（1.大庆医学高等专科学校，黑龙江 大庆 163312；2.大庆油田总医院，黑龙江 大庆 163111）

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的颅内恶性肿瘤,在胶质瘤中约占50%[1]，其呈浸润性生长，具有高复发率、高死亡率的特点。手术很难完全切除，且对化、放疗具有明显的抵抗性。GBM 患者经过治疗后的平均生存时间仅为14.6个月[2]，因此迫切需要寻找新的有效治疗胶质瘤的药物。

凋亡素（Apoptin）是来自鸡贫血病毒的蛋白质，已经证实其具有诱导包括胶质瘤细胞在内的70多种肿瘤细胞凋亡，并且无化疗耐药性的特点，被视为“抗肿瘤明星分子”[3]。凋亡素通过下调HSP70促进肿瘤细胞凋亡和诱发有丝分裂灾变[4]。但凋亡素是大分子蛋白质，到体内后可能会产生一定的免疫原性而导致一定的副反应，因此，试想如果对凋亡素的结构进行改造，利用其发挥效应的序列构建一分子多肽片段，即凋亡素衍生肽，可能会起到更好的抗肿瘤效果，而且极大减少其对机体免疫原性反应。

本研究在确定HSP70在胶质瘤细胞中高表达的基础上，通过蛋白质与核酸之间的相互作用对凋亡素分子序列进行分析，构建出凋亡素衍生肽（ADP），并证实ADP能够通过下调HSP70的表达而抑制神经胶质瘤细胞增殖和生长，并证明该凋亡素衍生肽的作用优于凋亡素以及常规化疗药物，进而为进一步开发治疗GBM的药物，提供有力依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

人神经胶质瘤细胞系U87-MG和U251-MG，GEM患者标本，多肽，质粒。

1.2 研究方法

1.2.1 通过对照实验，利用Western印迹分析、免疫组化、RT-PCR技术证实HSP70在胶质瘤组织和细胞中表达均高于正常组织细胞。

1.2.2 利用蛋白质与核酸之间的相互作用确定的凋亡有效片段，构建出了凋亡素衍生肽（ADP），并对其作用进行评估；利用分析软件对ADP的3D结构进行分析，证实该衍生肽片段与理论值一致。

1.2.3 通过对ADP与凋亡素、常规化疗药物导致GBM细胞凋亡的比照分析，证实ADP促进GBM细胞凋亡程度更大。

1.2.4 通过ADP治疗组和未治疗组的HSP70表达下调程度与细胞核凋亡程度的分析，证实了ADP可通过降低HSP70的表达诱导胶质瘤细胞凋亡。

2 结 果

2.1 HSP70在GBM样本和正常脑组织的表达情况的对照分析

Western-blotting分析结果显示了GBM中HSP70的表达高出正常脑组织（NBT）的3倍（图1）。免疫组化结果显示HSP70表达在胶质瘤中显著增加（图2）。qRT-PCR分析结果结果显示HSP70在胶质瘤组织中和GBM细胞中的表达与NBT相比显著增加（图3）。同时也由此得出，U87-MG和U251-MG能够作为本研究中GMB细胞的合适模型。

图1

图2

图3

2.2 凋亡素衍生肽（ADP）的设计与结构分析

通过系列分析，筛选出凋亡素衍生肽有效序列，并构建出ADP，并通过体外pull-down测定裂解物、免疫共沉淀分析与免疫荧光分析证实其与HSP70间的相互作用。结果表明ADP多肽可以有效降低HSP70在细胞中的表达。利用分析软件对ADP的3D结构进行分析，结果表明其与理论值的一致。

2.3 验证ADP通过降低HSP70表达诱导胶质瘤细胞凋亡

比较ADP-未处理和ADP处理的293和U87 - MG细胞的核蛋白的凋亡程度，进行核凋亡分析。Western blotting和免疫细胞化学分析结果均表明HSP70被表达。从细胞核形态显示ADP治疗组导致的凋亡更为明显，表明ADP具有强烈的诱导U-87细胞凋亡的能力。

3 结论与讨论

本研究为进一步寻求确定最短的序列凋亡素可以促进HSP70下调，并模拟凋亡素的抑制活性，在对凋亡素序列分析的基础上，除去了NES（氨基酸：97-105）结构域并保留了NLS1和NLS2结构域，由LRS连接，并在N上添加了一个TAT序列该肽的末端用作标签，进而构建出凋亡素衍生肽ADP。通过一系列实验证明了ADP保留绝大多数抗肿瘤特异性靶标的凋亡素的功能，其抑制GBM细胞中的HSP70转录并发挥的作用比凋亡素在促进肿瘤细胞中的作用更强。因此，研究结果表明合成凋亡肽衍生肽具有较好的抑制GMB生长和侵袭作用。此外，鉴于HSP70在正常细胞中几乎不表达[5]，因此ADP似乎可以作为理想的药物用于GMB的治疗，由此为GBM的治疗提供了一种新的思路。