基于巨噬细胞活性成像探针的研究进展

符纯美　刘义成　张建标　张弛　晏丽　吴鹏　闫新豪

摘      要： 巨噬细胞是具有多功能的免疫细胞，在抵御病原体及组织损伤和重构方面发挥至关重要的作用。由于巨噬细胞影响机体内多个生物学进程，其活性检测在炎症微环境和肿瘤的基础研究及诊断方面具有重要意义。成像探针以其选择性强、灵敏度高、响应快、成本低廉等优点深受研究者的青睐，在医学成像方面作为一种直观、原位的可视化观测技术，其在患者临床结果的预测、治疗方案的确定和治疗反应的监测方面的应用已成为研究热点。近年来，相继发展了大量可用于生物体内巨噬细胞活性成像的探针，对各种成像探针及其应用情况进行综述，并对未来研究方向进行展望。

关  键  词：巨噬细胞;成像探针;肿瘤微环境;炎症微环境;细胞成像

中图分类号：TQ460.7+2        文献标识码： A        文章编号： 1671-0460（2020）07-1509-05

Research Progress of Macrophage Activity Imaging Probe

FU Chun-mei， LIU Yi-cheng， ZHANG Jian-biao， ZHANG Chi， YAN Li， WU Peng， YAN Xin-hao*

（Hanzhong Vocational and Technical College， Hanzhong Shaanxi 723000， China）

Abstract： Macrophages are multifunctional immune cells， which play an important role in resisting pathogens and tissue damage and remodeling. Macrophages have close relationship with many biological processes in the body， their activity detection is of great significance in the basic research and diagnosis of inflammatory microenvironment and tumor. Imaging probe is favored by researchers for its advantages of high selectivity， high sensitivity， fast response and low cost. In medical imaging， as an intuitive， in-situ visual observation technology， it has become a research hotspot for the prediction of patients' clinical results， the determination of treatment plans and the monitoring of treatment response. In recent years， a large number of imaging probes which can be used to illustrate macrophage activity in vivo have been developed. In this paper， various imaging probes and their applications were reviewed， and the future research direction was prospected.

Key words： Macrophages; Imaging probe; Tumor microenvironment; Inflammatory microenvironment; Cell imaging

1  引言

高分辨光學成像技术为活体细胞的可视化成像及相关生物学事件动态监测提供了技术支持。近年来，随着对荧光探针的不断深入研究，通过特定信号分子或蛋白质激活发射荧光信号的化合物，以其高分辨、高信噪比和高灵敏度的特点正在敲开活细胞实时成像检测的大门。这种荧光探针结构被认为是智能荧光团，通过合理的结构设计实现对目标物诱导的荧光响应，智能荧光团结构设计中用有机化学工具在分子片段中搭建“off-on”架构，用化学生物学方法提高探针靶向性。用于细胞活性成像的成像探针在生物学和医学研究中提供了一系列的可能性，从活体内生物进程的监测到健康状态和疾病状态模式差异的可视化，从而应用于疾病诊断与新药发现。

巨噬细胞在宿主防御中发挥重要功能，它们通过吞噬作用清除凋亡细胞、碎片及病原体;通过分泌细胞因子、酶及其他因子形成炎症反应;通过向淋巴细胞呈递抗原来调节适应性免疫（获得的特异性免疫能力）。虽然这些功能将有益于宿主，但越来越多的证据表明巨噬细胞在一些情况下也可能有害，例如：恶性肿瘤组织有大量的巨噬细胞，称作肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages， TAMs），作为一种炎症反应的组成部分，参与肿瘤细胞外基质构建^[1]。肿瘤可通过远距离分泌方式分泌多种生物活性因子，使巨噬细胞祖细胞从肿瘤基质中扩增出来，在局部肿瘤微环境中聚集从而发挥其作用，这些TAMs促进肿瘤增生及转移功能的获得，并在肿瘤浸润、转移过程中扮演着十分重要的角色，研究表明具有丰富的TAMs的肿瘤进展速度更快^[2-5]。巨噬细胞参与炎症的发生及动脉粥样硬化斑块的形成^[6]，容易导致心脑血管系统疾病（如心肌梗死与中风）的发病，心肌梗死后不受控制的炎性巨噬细胞可引起心室重塑、心力衰竭和死亡，以及类风湿关节炎^[7]、肥胖^[8]和糖尿病^[9]等疾病的发生，因此对组织巨噬细胞（密度、流量、功能和亚型）的成像监测具有重要的临床和研究应用价值。

成像探针以其选择性强、灵敏度高、响应快、成本低廉等优点深受研究者的青睐，在医学成像方面作为一种直观、原位的可视化观测技术用于患者临床结果的预测、治疗方案的确定和治疗反应的监测。巨噬细胞通过分泌细胞因子、酶和活性氧（ROS）在宿主对感染性疾病的反应中发挥作用，这些特性可以作为成像诊断和新药研发的靶点，促进了巨噬细胞活性监测成像探针的发展。近年来，相继发展了大量可用于生物体内巨噬细胞活性成像探针，本文对各种成像探针及其应用情况进行综述，并对未来研究方向进行展望。

2  设计策略

ROS和活性氮（RNS）与巨噬细胞的许多功能直接相关。活化的巨噬细胞可产生大量的ROS，生理或病理条件下，巨噬细胞产生释放的ROS对微生物的吞噬作用、炎症反应和组织损伤产生重要影响。巨噬细胞释放ROS作为第二信使来调节参与细胞增殖、凋亡和基因表达的信号通路。过氧化氢（H₂O₂）是巨噬细胞内最重要的内源性ROS之一。在吞噬细胞时，氧化酶Nox2被激活产生超氧化物（O₂˙?），其发生歧化形成H₂O₂和随后的次氯酸（HOCl）。由于其存在时间短，巨噬细胞中H₂O₂含量在纳摩尔范围内，因此需要高度灵敏的探针进行实时成像。大多数用于巨噬细胞中H₂O₂可视化的成像探针依赖于含有H₂O₂响应的荧光团。硼酸酯^[10]、膦酸酯^[11-12]和苯甲酰羰基^[13]被用来作为ROS信号导入基团，这些基团引入到荧光团特定位置用于调节内部电荷或电子转移性质，使得荧光只在H₂O₂化学选择性切割时引起。

3  研究进展

2010年Chang课题组^[10]设计合成了一系列不同发光色的成像探针1（如图 1），硼酸酯连接于荧光素或罗丹明发光团的酚羟基处实现荧光信号的开关，具有激发发射光谱可调谐的优点和对内源性H₂O₂细胞水平的敏感响应的特性。该探针应用于巨噬细胞吞噬性呼吸爆发成像检测，在多色成像实验中，具有择性地鉴别活的巨噬细胞中H₂O₂和次氯酸（HOCl）水平的变化。此外，当用合成的成像探针和标记的巨噬细胞被刺激以诱导免疫应答时，发现了3种不同类型的吞噬体，用于区别不同的ROS，探针表现出对过氧化氢良好的选择性，对两种豚尸体实现了检测，有助于揭示ROS在细胞中的生成及分布。

2018年，Shao等^[14]设计合成了探针2 （如图 2），该报道提出了一种新型的多通道信号电化学荧光探针，用于活体细胞中H₂O₂的成像和檢测。探针由H₂O₂反应位点硼酸酯和4-二茂铁基（乙烯基）吡啶单元组成，提供显色、荧光和电化学信号。这些结构单元在单分子中集合了显色、荧光和氧化还原传感功能。裸眼观察，当H₂O₂加入含探针的缓冲溶液中时，观察到从淡红色到无色的明显颜色变化;在激发光激发下，探针显示出对H₂O₂的高灵敏度和选择性的“turn on”荧光响应，这可以应用于监测细胞内H₂O₂活性;电化学检测时，加入H₂O₂后，探针的电化学响应信号降低，可作为检测活细胞释放H₂O₂的简便方法，该探针成功应用于巨噬细胞释放H₂O₂的成像检测。

2007年，Tang等^[15]设计合成了基于膦酸酯响应的探针3（如图 3），以荧光素作为发光团，膦酸酯基作为与O₂˙?反应位点，脱保护后表现为“turn on”模式得到荧光素，探针合成方法简单、新颖。在与O₂˙?反应时，该探针具有较强的荧光响应性、对细胞内其他ROS高选择性且检测线性范围宽、检测极限低的优点，添加超氧化物歧化酶清除剂证实了探针对O₂˙?特异性反应。探针具有良好的选择性、高灵敏度、良好的水溶性和响应性应用于小鼠腹膜巨噬细胞成像，携带探针的巨噬细胞显示细胞内弱背景荧光，当PMA激发后表现了强荧光信号，这些结果表明探针能特异性地响应活细胞内O₂˙?浓度的变化，该探针将有助于研究超氧化物介导的细胞代谢与损伤修复中的作用及其机制。

2017年，Liu等^[16]报道了基于喹啉衍生物双光子荧光探针4（如图 4），6-二甲氨基-喹啉-2-苯并噻唑啉。该探针噻唑啉环与O₂˙?反应得到噻唑环延长π-共轭激活荧光信号，探针在O₂˙?浓度范围内具有选择性和快速的“开启”响应，在浓度范围内具有良好的线性相关性和稳定性。此外，探针在细胞内和生物体显示出良好的双光子荧光特性、优异的光学稳定性、低的细胞毒性、优异的组织穿透性。首次通过双光子荧光成像技术跟踪体内炎症组织内源性产生的O₂˙?指示剂，这显示了快速原位检测活生物体中炎症反应的潜力，有望成为研究超氧阴离子在各种生理和病理过程作用机制的有力工具。

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基金项目：陕西省教育厅科研计划项目（项目编号：18JK0922和18JK0921）;汉中职业技术学院科研计划项目（项目编号：HZYKYZD201701）;

中科院“西部青年学者”B类项目（项目编号：Y82A570Q10）。

收稿日期：2020-02-11

作者简介：符纯美（1978-），女，陕西汉中人，讲师，硕士，2010年毕业于沈阳药科大学生物药学专业，研究方向：药物检测分析和新药研发。E-mail：920175446@qq.com。

通讯作者：闫新豪（1982-），男，教授，博士，研究方向：纳米医学。E-mail：wide123@163.com。