聚酰胺纯化膜苞鸢尾中总黄酮的工艺研究

2020-08-23杨阳张小杰高文运赵长琦

当代化工 2020年7期

杨阳　张小杰　高文运　赵长琦

摘要：目的研究聚酰胺柱色谱纯化膜苞鸢尾中总黄酮的工艺条件。方法以膜苞鸢尾中總黄酮的解析率与纯度为指标，通过考察静态、动态吸附试验，优化聚酰胺纯化膜苞鸢尾中总黄酮的工艺条件。结果聚酰胺对总黄酮有良好的纯化效果，其优化工艺为：最佳上柱样品溶液质量浓度2.0 mg·mL^-1，pH=3，吸附流速1 BV·h^-1，吸附1.5 h后，70%乙醇洗脱液以1 BV·h^-1速度洗脱。总黄酮动态解析率为92.34%，纯度45.59%。结论聚酰胺对膜苞鸢尾中总黄酮纯化性能较高，纯度提高了2.9倍。

关键词：紫外分光光度法;聚酰胺;膜苞鸢尾;总黄酮;纯化工艺

中图分类号：TQ 041 文献标识码： A 文章编号： 1671-0460（2020）07-1281-05

Purification of Total Flavonoids From Iris scariosa by Polyamide Resin

YANG Yang1， ZHANG Xiao-jie1， GAO Wen-yun2， ZHAO Chang-qi3

（1. College of Pharmacy， Xi'an Medical University， Xi'an Shaanxi 710021， China;

2. Northwest University National Micro-detection System Engineering Research Center，

College of Life Science， Northwest University， Xian 710069， China;

3. School of Life Science， Beijing Normal University， Beijing 100875， China）

Abstract： Objective： To optimize the purification method of total flavonoids from Iris scariosa by polyamide resin. Methods： Using the desorption ratio and purity of total flavonoids from Iris scariosa as the indices， the purification of total flavonoids by polyamide resin was optimized with static and dynamic adsorption tests. Result： The optimal adsorption conditions were as follow： the concentration of sample solution was 2.0 mg·mL-1， pH was 3 and the flow velocity of adsorption was 1 BV·h-1， the sample solution was rested for 1.5 h in the chromatographic column of polyamide resin. 70% ethanol was used to elute the total flavonoids at the flow rate of 1 BV·h-1. The dynamic desorption ratio was 92.34% and the purity of total flavonoids was 45.59%. Conclusion： The total flavonoids in Iris scariosa was effectively purified by polyamide resin under the optimal conditions with 2.9 times increase.

Key words： UV spectrophotometry ; Polyamide resin; Iris scariosa; Total flavonoids; Purification process

膜苞鸢尾（Iris scariosaMaxim）是鸢尾科鸢尾属植物，为新疆中草药镰叶马蔺根的药材基源，具有清热解毒、祛痰、利咽的功效^[1]。研究证明，鸢尾属植物中的主要活性成分为鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素等黄酮类成分，具有抗炎、抗病毒等药理活性^[2-3]。本课题组首次系统研究了膜苞鸢尾的化学成分，并对分离得到的化学成分的抗炎活性进行了评价^[4-5]。聚酰胺树脂主要通过氢键和范德华力对黄酮类化合物进行吸附，具有方法简单、成本低、稳定性高和容易再生等特点，现已广泛用于黄酮类物质的纯化^[7-10]。

本实验首次对聚酰胺柱色谱技术富集膜苞鸢尾总黄酮进行了研究，取得较好效果，可为膜苞鸢尾总黄酮的进一步开发和利用提供参考。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

柱色谱用聚酰胺（30～60目（550～250 μm）、60～100目（250～150 μm）、100～200目（150～75 μm）），浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂;鸢尾苷标准品，批号JZ15020119，HPLC≥98%，南京景竹生物科技有限公司;膜苞鸢尾采自新疆察布查尔锡伯族自治县，经北京师范大学刘全儒教授鉴定为鸢尾科鸢尾属植物膜苞鸢尾（Iris tectoroum Maxim）;无水乙醇、甲醇、NaOH、盐酸，分析纯，天津市红岩化学试剂厂;蒸馏水，西医阳光水站。

BS210S电子分析天平，北京赛多利斯天平有限公司;电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂;紫外分光光度计，UV-1780日本岛津;DZF-6020型真空干燥箱，上海琅玕实验设备有限公司;KQ5200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

精密称取鸢尾苷对照品5 mg，置于10 mL容量瓶中，用70%的乙醇溶解并定容，摇匀。精密量取2 mL置于10 mL容量瓶中，用70%的乙醇定容刻度，作为对照品溶液。精确量取对照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mL，分别移入 10 mL容量瓶中，用70%的乙醇定容，摇匀。在266 nm处测定吸收值，以浓度为横坐标、吸收度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.2 上柱样品溶液的制备

膜苞鸢尾根及根状茎1.1 kg，剪碎后于室温下用甲醇浸泡6次，每次3 d，提取合并第2—6次浸提液，减压蒸馏得浸膏135.8 g。称取1.0 g干燥浸膏，加70%乙醇定容于500 mL量瓶中，制成质量浓度为2.0 mg·mL^-1上柱样品溶液。测得总黄酮的浓度0.32 mg·mL^-1。

1.2.3 树脂的筛选

1.2.3.1 树脂的预处理

聚酰胺30～60目（550～250 μm）、聚酰胺 60～100目（250～150 μm）、聚酰胺 100～200目（150～75 μm），分别先后在95%乙醇和5%的NaOH中浸泡24 h，水洗至中性后3% HCl浸泡24 h，再用水洗至中性，50 ℃干燥，密封备用。

1.2.3.2 树脂的静态吸附与解吸附性能考察

精确称取经预处理的干树脂1.0 g，置具塞锥形瓶中，加入膜苞鸢尾上柱样品溶液（浸膏质量浓度2.0 mg·mL^-1，总黄酮质量浓度0.32 mg·mL^-1）20 mL，充分震荡12 h，使达到饱和吸附，过滤，测定不同树脂吸附后残留液的吸光度，利用标曲计算残留液中总黄酮含量。依照下式计算不同树脂的总黄酮静态吸附量：

吸附量=（上柱样品溶液总黄酮浓度-吸附后残余液总黄酮浓度）×溶液体积÷干树脂量

用水洗去树脂上残留的上柱样品液，然后吸干表面水分，加入20 mL的70%乙醇洗脱，室温充分震荡12 h后过滤，测定不同树脂解吸液的吸光度，计算其中总黄酮含量，真空干燥后称量其固体重量。按照下式计算总黄酮解析率与纯度：

解析率=（解吸液总黄酮浓度×解吸液体积）÷吸附量×100%

纯度=（解吸液总黄酮浓度×解吸液体积）÷解吸液固体重量×100%

1.2.3.3 树脂的动态吸附与解吸附性能考察

精确称重1.0 g经预处理的干树脂，95%的乙醇浸泡过夜，分别装入统一规格的玻璃柱中（1.5 cm×30 cm），用20 BV水替换。加入20 mL膜苞鸢尾上柱样品溶液（浸膏质量浓度2.0 mg·mL^-1，总黄酮质量浓度0.32 mg·mL^-1），1 BV/h的速度上柱吸附，测定不同树脂动态吸附后残留液的吸光度，计算其中总黄酮含量。静置吸附1 h后，以1 BV·h^-1速度，加入20 mL水，洗去样品液的残留，然后加入70%乙醇洗脱液20 mL（4 BV），以1 BV·h^-1速度洗脱。收集不同树脂洗脱液，测定不同树脂解吸液的吸光度，计算其中总黄酮含量，真空干燥后称量解析液固体重量。

1.2.4 聚酰胺分离纯化膜苞鸢尾中总黄酮的工艺参数考察

1.2.4.1 上样液浓度的影响

分别精确称取不同质量的膜苞鸢尾浸膏1.0、1.5、2.0、3.0 g，70%乙醇溶解于500 mL量瓶中，超聲30 min并定容至刻度，按照“1.2.3.3”项下方法操作，计算不同浓度的膜苞鸢尾浸膏样品溶液在聚酰胺柱色谱上解析率和纯度。

1.2.4.2 泄露曲线的绘制

将膜苞鸢尾浸膏质量浓度为2.0 mg·mL^-1（总黄酮浓度0.32 mg·mL^-1）的上柱样品溶液按照“1.2.3.3”项下上柱方法操作，每10 mL一个流份，上柱110 mL，测定各个流份的吸光度，计算每个流份中总黄酮含量。

1.2.4.3 上柱样品溶液pH值的考察

将膜苞鸢尾浸膏质量浓度为2.0 mg·mL^-1（总黄酮质量浓度0.32 mg·mL^-1）且pH值分别为1.0、3.0、5.0、7.0、9.0的上柱样品溶液各20 mL按照“1.2.3.3”项下方法操作，收集不同pH值的洗脱液，测定吸光度，计算不同pH值的膜苞鸢尾在聚酰胺柱色谱上吸附量和解析率。

1.2.4.4 吸附时间

将膜苞鸢尾浸膏质量浓度为2.0 mg·mL^-1（总黄酮质量浓度0.32 mg·mL^-1）且pH值为3.0的上柱样品溶液20 mL按照“1.2.3.3”项下的方法，分别静置吸附0、0.5、1、1.5、2 h，收集不同吸附时间的解吸液，测定吸光度。

1.2.4.5 吸附速度

将膜苞鸢尾浸膏质量浓度为2.0 mg·mL^-1（总黄酮质量浓度0.32 mg·mL^-1）且pH值为3.0的上柱样品溶液20 mL按照“1.2.3.3”项下的方法，分别控制吸附速度为1、2、4 BV·h^-1，静置1.5 h后，收集解吸液，测定吸光度。

1.2.4.6 洗脱剂浓度的影响

将膜苞鸢尾浸膏质量浓度为2.0 mg·mL^-1（总黄酮浓度0.32 mg·mL^-1）且pH值为3.0的上柱样品溶液20 mL按照“1.2.3.3”项下上柱方法操作，静置1.5 h后，分别用10%、20%、30%、50%、70%、95%乙醇等度或梯度洗脱，测定各解吸液的吸光度。

1.2.4.7 洗脱剂用量考察

将20 mL pH值为3.0上样液（膜苞鸢尾浸膏质量浓度为2.0 mg·mL^-1），按照“1.2.3.3”项下方法操作，静置1.5 h之后以80 mL的70%乙醇洗脱，每10 mL一个流份，收集8个流份，测定吸光度，计算每个流份中总黄酮含量。

1.2.4.8 验证试验

将膜苞鸢尾浸膏质量浓度为2.0 mg·mL^-1且pH值为3.0的上柱样品溶液20 mL按照“1.2.3.3”项下上柱方法操作，按照1 BV·h^-1速度吸附，静置吸附1.5 h后，按照1 BV·h^-1的速度用20 mL 的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定吸光度，平行试验3次，计算解吸液中总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 鸢尾苷的标准曲线

测定得到回归方程y=72.82x+0.002（x为鸢尾苷标准品质量浓度，mg·mL^-1;y为吸光度值A），相关系数r=0.999 5。结果表明，鸢尾苷对照品在0.001 08～0.010 8 mg·mL^-1呈良好的线性关系。

2.2 树脂的筛选

对3种型号树脂的静态和动态吸附与解吸附性能考察结果表明，吸附量与纯度最高的都是聚酰胺100～200目（150～75 μm），因此选择聚酰胺100～200目（150～75 μm）树脂进一步分离纯化总黄酮，结果见表1和表2。

2.3 聚酰胺分离纯化膜苞鸢尾中总黄酮的工艺参数考察

2.3.1 上样液浓度的影响

由表3可知，上样液中膜苞鸢尾浸膏质量浓度为2.0 mg·mL^-1时，总黄酮的解析率与纯度最高，因此可作为最适的上样液浓度。

2.3.2 泄露曲线的绘制

从图1可以看出，上样液中浸膏质量浓度为2.0 mg·mL^-1时，体积40 mL时泄露开始。

2.3.3 上柱样品溶液pH值的考察

由表4可知，从解析率考虑上柱样品溶液的最佳pH值为3.0。

2.3.4 吸附时间

由表5可知，从纯度与解析率考虑最佳吸附时间为1.5 h。

2.3.5 吸附速度

由表6可知，从吸附量与解析率考虑，选择最佳吸附速度为1 BV·h^-1。

2.3.6 洗脱剂浓度的影响

由图2、图3可知，解析液的总黄酮纯度在70%乙醇浓度洗脱时达到最高，因此选用70%乙醇洗脱液进行洗脱。

2.3.7 洗脱剂用量考察

由图4可知，第一个10 mL（2 BV）的流份中，总黄酮含量最高。20 mL（4 BV）洗脱剂基本可洗脱完全，因此洗脱剂选用20 mL（4 BV）70%乙醇进行洗脱。

2.3.8 验证试验结果

纯化前总黄酮纯度为15.81%，经聚酰胺纯化后总黄酮纯度为45.59%，富集作用明显。验证实验结果见表7。

3 结论

本试验尝试使用聚酰胺纯化膜苞鸢尾中总黄酮，经聚酰胺处理后总黄酮纯度达到43.35%以上，比原浸膏总黄酮纯度15.81%提高2.9倍左右，表明聚酰胺对膜苞鸢尾中总黄酮具有特异性吸附和解吸附性能，富集效果好，总黄酮纯度明显提高，可作为膜苞鸢尾总黄酮分离纯化的有效手段^[11，12]，可为膜苞鸢尾总黄酮的进一步开发利用提供参考。

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