重组运动发酵单胞菌乙醇发酵效果的研究

李北　汪浩勇　William Wang　李永恒　郭春雷　黄加军

摘      要：运动发酵单胞菌通过ED途径高效转化单糖生成乙醇，其生长不需氧气，能够以N₂作为氮源，抗逆性强;其乙醇发酵速度快，乙醇理论产率高，生产周期较短和原料利用率较高，容易进行基因工程改造。本文采用水稻和木薯为乙醇发酵的原料，研究重组运动发酵单胞菌的发酵特点，验证其乙醇发酵性能，为其今后在乙醇生产中实际使用积累经验和提供参考依据。本实验结果证明，与安琪超级酿酒干酵母相比，在重组运动发酵单胞菌的乙醇发酵过程中，CO₂产量更低导致发酵失重更少，乙醇产量明显增加，最佳发酵温度更高，淀粉出酒率更高和淀粉利用率更高。重组运动发酵单胞菌对安菌泰和青霉素有较强的耐受性，乙醇发酵指数期大约为0～40 h，种子扩大培养期间不需要添加任何外来氮源。

关  键  词：运动发酵单胞菌;乙醇发酵;水稻;木薯

中图分类号：TQ 920.6     文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）07-1400-06

Study on Ethanol Fermentation Effect of Recombinant Zymomonas Mobilis

LI Bei 1*， WANG Haoyong 2*， William Wang 3 ， LI Yongheng 1， GUO Chunlei 1， HUANG Jia-jun1

（1. Guangxi COFCO Bio-energy Co.， Ltd.， Beihai Guangxi 536100，China;

2. Key Laboratory of Fermentation Engineering of Ministry of Education， Hubei University of Technology，

Wuhan Hubei 410068， China;

3. Harriton High School， Rosemont PA USA 19010; *· Contributed equally to this work）

Abstract： Zymomonas mobilis can efficiently transform monosaccharides to produce ethanol through ED pathway. Its growth does not require oxygen， can use N2 as a nitrogen source and is highly resistant to stress. Its ethanol fermentation speed is fast and the production cycle is short. Its theoretical ethanol yield is high and the raw material utilization rate is high. It is easy to carry out gene manipulation for genetic transformation. In this paper， ethanol fermentation of new typed recombinant Z. mobilis strains was studied by using rice or cassava as raw materials. Compared with the Angel yeast of Saccharomyces cerevisiae， in the ethanol fermentation process， the CO2 production of the Z. mobilis is significantly lower， and the ethanol production is significantly higher. Its optimal fermentation temperature is higher， starch liquor yield and starch utilization rate are significantly higher， and acid production is lower. It has a strong tolerance to Penicillin. The ethanol fermentation index period is between 0～ 40 h， and no external nitrogen source is needed during its seed expansion cultivation.

Key words： Zymomonas mobilis; Ethanol fermentation; Rice; Cassava

與酵母菌乙醇发酵的代谢途径不同， 运动发酵单胞菌^[1]（Zymomonas mobilis， Z. mobilis）通过ED途径高效转化葡萄糖和果糖生产乙醇。Z. mobilis具有菌体生长少、生长不需氧气、能够将N₂作为氮源^[2]、副产物少、乙醇耐受力和温度耐受力强、具有良好的遗传改良性等特征，其乙醇发酵速度和产乙醇理论值均高于酵母菌，生产周期短和原料利用率高。Z. mobilis长期被寄予厚望，有希望成为跟酵母一样大量使用的乙醇发酵菌种。

采用合成生物学技术，湖北工业大学汪浩勇教授团队开发出了能在无蛋白培基中高速、高效、高密度发酵生产乙醇的重组Z. mobilis菌种^[3-8]。在无氨基酸无维生素的化学培养基中，这些新Z. mobilis能高效利用木糖、阿拉伯糖、甘露糖或葡萄糖来高产乙醇;在营养合适和优化的培养基中，利用上述各种单糖及其任意糖的组合，新Z. mobilis的乙醇产量接近最高理论值。该细菌可以高效利用含有大量木糖的农作物秸秆制备乙醇，乙醇产量接近木糖或葡萄糖的最高理论产值。

与安琪超级酿酒干酵母进行对比，使用上述重组菌种，本项目的实验目的是研究新Z. mobilis的发酵特点，验证其发酵性能以及使用可行性，为今后乙醇生产使用新Z. mobilis提供参考依据。

1  试验内容

1.1  菌株

重组Z. mobilis菌种（D号、E号、4号、6号、9号、616号），来源于湖北工业大学汪浩勇教授实验室。安琪超级酿酒高活性干酵母，来源于宜昌安琪酵母股份有限公司。

1.2  材料与试剂

木薯，广西地区种植加工的干片;a-淀粉酶（10万U·g^-1），诺维信（中国）生物技术有限公司;尿素，安徽金禾化工有限公司;青霉素，石家庄华北制药股份有限公司;安菌泰，柳州龙泰科技有限公司;盐酸，济南坤丰化工有限公司; 硫酸，广西银泉化工有限责任公司;氢氧化钠、次甲基蓝指示剂、斐林试剂、酚酞指示剂，广西天地扬生物科技有限公司。

1.3  仪器与设备

上海百仑生物50 L全自动三联发酵罐，高效液相色谱（HPLC），全自動进样顶空高效气相色谱仪，快速水分测定仪，恒温摇床，恒温培养箱，恒温水浴锅，高速离心机，酸度计，电子分析天平，可控温电炉，容量瓶，三角瓶，离心管，量筒，移液枪，烧杯，玻璃棒，高压灭菌锅，无菌操作台，针筒式滤膜过滤器，722 可见分光光度计，pH 计。

1.4  实验方法

1.4.1  木薯原料菌种活化

取木薯粉配制固形物含量28%的粉浆，调节pH至5.60左右，添加杰能科淀粉酶（0.1 kg·t^-1木薯）进行液化，87～90 ℃液化2.5 h，冷却后调节pH至4.40左右，添加隆科特糖化酶（1.0 kg·t^-1木薯），60 ℃糖化40 min，然后冷却，分装至三角瓶，添加尿素（1.3 kg·t^-1木薯）和菌种（2%液化醪）摇匀，用发酵栓封口，于34 ℃恒温培养箱培养24 h，得到菌种活化液。

1.4.2  木薯原料发酵试验

取木薯粉配制固形物含量28%的粉浆，调节pH至5.60左右，添加杰能科淀粉酶（0.1 kg·t^-1木薯）进行液化，87～90 ℃液化2.5 h，冷却后调节pH至4.40左右，添加隆科特糖化酶（1.0 kg·t^-1木薯），60 ℃糖化4 0 min，然后分装至三角瓶，添加尿素（1.3 kg·t^-1木薯）和菌种（2%液化醪）摇匀，用发酵栓封口，称重，发酵70 h，发酵结束检测发酵指标，同时进行液相检测分析，并计算淀粉出酒率和淀粉利用率^[9]。

1.4.3  水稻原料菌种活化

车间取二冷水稻液化醪，将pH值调至4.40左右，添加隆科特糖化酶（1.0 kg·t^-1水稻）60 ℃糖化40 min，然后分装至三角瓶，添加尿素（1.3 kg·t^-1水稻）和菌种（2%液化醪）摇匀，用发酵栓封口，称重，于34 ℃恒温培养箱培养过夜，得到菌种活化液。

1.4.4  水稻原料菌种发酵

车间取二冷水稻液化醪，将pH值调至4.40左右，添加隆科特糖化酶（1.0 kg·t^-1水稻）60 ℃糖化40 min，然后分装至三角瓶，添加尿素（1.3 kg·t^-1水稻）和菌种（2%液化醪）摇匀，用发酵栓封口，称重，发酵70 h，发酵结束检测发酵指标，同时进行液相检测分析，并计算淀粉出酒率和淀粉利用率^[10]。

1.4.5  分析检测

采用酶解法测定淀粉含量;采用斐林试剂热滴定定糖法测定还原糖、总糖的含量;采用血球计数板法检测酵母质量;采用乙醇厂常用方法测定外观糖度、乙醇度、挥发酸、酸度等。

1.4.6  淀粉出酒率和淀粉利用率计算公式

淀粉出酒率% =

（产酒体积分数%×乙醇密度）/淀粉含量×100%

淀粉利用率% = 淀粉出酒率%/理论出酒率%×100%

2  结果与讨论

2.1  乙醇发酵过程失重动态图

乙醇发酵是一个微生物将单糖分解、不断生成乙醇及CO₂的过程。除极少量溶解于发酵醪中外，绝大部分CO₂逃逸造成失重。根据发酵过程中CO₂气体排放量即失重动态，可以比较准确地把握乙醇发酵进程的状态。

分别在33 ℃或36 ℃条件下进行乙醇发酵实验，设立不用抗生素、使用安菌泰或使用青霉素3种实验组，实验结果如图1所示。从图1可以看出，在6种不同的乙醇发酵条件下，大约在0～40 h期间，Z. mobilis乙醇发酵处于指数期，在此期间失重量以几何级数增加，这可能因为此时期的微生物生长、发酵物底物和外界环境处于最佳状态。大约40 h以后，乙醇发酵进入稳定期，然后迅速进入静止期，失重和乙醇生成速度大幅减缓，这可能因为营养的消耗使营养物比例失调、有害代谢产物积累、pH值等理化条件不适宜。

2.2  种子扩大培养期间使用糖化酶对乙醇产量的影响

现代乙醇发酵工业生产的每只发酵罐的容积一般有几百甚至几千立方米，因此要在短时间内完成发酵，必须要有数量巨大的微生物细胞才行。种子扩大培养的任务就是要获得数量足够的健壮的微生物，是指将处休眠状态的生产菌种接入种子罐进行培养，从而获得一定数量和质量的纯种过程，可以导致产率显著提高，杂菌污染的防止效果也更高了。

   糖化酶又称葡萄糖淀粉酶，它能把淀粉从非还原性未端水解a-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖;也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖;同时也能水解糊精和糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。糖化酶导致产生可供细菌生长和发酵性的糖类。

本实验的微生物扩培时，液化醪先经过添加糖化酶或不添加糖化酶两种方法处理，上述糖化液经过无菌分装入不同的三角烧瓶，各瓶按2%液化醪的比例分别加入一种微生物后，进行34 ℃过夜扩培，共获得8种Z. mobilis活化菌种。然后扩培的微生物按2%的比例加入水稻糖化醪进行乙醇发酵，经过34 ℃发酵72 h后，对发酵液进行测定，结果如表1所示。由表1可以看出，在相同发酵条件下，Z. mobilis产乙醇的浓度明显高于安琪酵母;在微生物扩大培养过程中，使用或不使用外源的糖化酶，细菌发酵生成乙醇的浓度并没有显著差异，因此活化阶段糖化酶的使用与否对细菌乙醇产量影响不大。结果表明这些Z. mobilis本身可能具有自我合成高活性的糖化酶的能力。

2.3  添加不同氮源对乙醇产量影响

微生物的生长和产物合成需要氮源，氮源主要用于菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物的合成。乙醇发酵常用的添加氮源包括硫酸铵和尿素。

由于缺乏足够的氮元素，利用酵母发酵纤维素生产乙醇时，经常需要补充NH₄⁺和工业用氮补充剂。而Z. mobilis能够仅使用N₂气作为氮源就可以不牺牲乙醇产量。基因组学证据表明，N₂固定可能是许多Z. mobilis菌株的保守性状。例如菌株ATCC 29192，似乎具有额外的N₂固定多功能性，除了Mo-硝化酶外还编码Fe-硝化酶。Z. mobilis固氮特点带来的经济和环境效益，将显著降低纤维素乙醇的生产成本。从表2可以看出，616号菌株似乎具有较强的N₂固定功能性，对于水稻糖化醪，不需要添加任何外来氮源，616号菌株就能高产乙醇。

2.4  抗生素对细菌的影响

乙醇发酵工业经常遭受着杂菌污染的威胁。凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染，杂菌污染后轻者影响产率、产物提取收得率和产品质量，重者造成“倒罐”，不但浪费大量原材料，造成严重的经济损失，还会对周围环境造成破坏。加入适量的抗生素或杀菌剂，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。

采用安菌泰和青霉素作为抑菌剂，同时设立了无抑菌剂对照组和安琪酵母发酵添加安菌泰的对照组，本试验对4号菌Z. mobilis和安琪酵母同时进行33 ℃和36 ℃的发酵实验。实验结果如表3所示。

试验结果表明，在相同发酵条件下，Z. mobilis的失重明显低于安琪酵母，并且最终乙醇的浓度也明显高于安琪酵母。Z. mobilis乙醇增产的原因，可能是由于发酵过程产生的CO₂比酵母较少而引起的。

在不同温度条件下，使用或者不使用安菌泰或青霉素，Z. mobilis发酵生成乙醇的浓度并没有显著差异，表明Z. mobilis对安菌泰和青霉素有较强的耐受性，其发酵过程不被一般浓度的安菌泰和青霉素抑制。因此，为了保险起见时，可以用安菌泰和青霉素来抑制Z. mobilis乙醇发酵过程中污染的杂菌。

2.5  细菌发酵木薯和水稻小试

此实验采用木薯和水稻为原料，发酵重量为400 g，使用Z. mobilis D号菌和E号菌种，同时设安琪酵母为对照，进行了两批试验，取两批试验结果平均值，实验结果如表4所示。

从残糖分析，3个菌种发酵结果没有太大差别。从产酸来看，3者挥发酸的区别不大，而酸度对比，D菌种和E菌种发酵的酸度明显比安琪发酵的酸度低。

水稻原料发酵中，三者的残淀粉基本一致，残糊精则是安琪酵母的较低;木薯原料发酵中，D菌种和E菌种发酵的残淀粉和残糊精均比安琪酵母低，尤其是E菌种发酵残淀粉比安琪发酵低33.8%，残糊精低20.0%。

从图2可看出，不管是用水稻原料还是用木薯原料，D菌种和E菌种的淀粉出酒率和淀粉利用率均比安琪发酵的高。D菌种水稻和木薯发酵的淀粉利用率分别比安琪发酵高4.82%和2.80%，E菌种水稻和木薯发酵的淀粉利用率分别比安琪發酵高5.07%和2.45%。

HPLC測定结果表5显示，D菌种和E菌种发酵的酒分明显比安琪酵母发酵的酒分高，D菌种水稻和木薯发酵分别比安琪发酵多产乙醇6.84%和4.30%，E菌种水稻和木薯发酵分别比安琪发酵多产乙醇6.78%和4.17%。

2.6  50 L发酵罐发酵水稻生产乙醇

用水稻为原料，使用50 L全自动发酵罐进行Z. mobilis 4号菌种乙醇发酵实验，同时设安琪酵母为对照，我们2018年进行了3批试验。

菌种活化过程如下：从车间取二冷32 ℃液化醪，调节pH至4.6左右，然后添加尿素（1.3 kg·t^-1水稻）、糖化酶（0.8 kg·t^-1水稻）、安菌泰（5 g·t^-1水稻）。取上述液化醪380 g置于无菌玻璃三角瓶中，加入Z. mobilis 4号菌种20 g，摇瓶振荡混匀，密封。将三角瓶放入33 ℃恒温箱，静止培养过夜，检测菌种培养液细菌数超过1.0亿·mL^-1后，即可进行乙醇发酵。

乙醇发酵过程如下：50 L发酵罐以及管道通蒸汽灭菌1 h后，加入40 kg二冷液化醪，调节pH至4.60左右，然后添加尿素（1.3 kg·t^-1水稻）、糖化酶（0.8 kg·t^-1水稻）、安菌泰（5 g·t^-1水稻），加入上一步骤的活化菌种400 g，发酵罐出气管用水密闭，Z. mobilis发酵控温至34 ℃，安琪酵母对照发酵控温至33 ℃，缓慢搅拌发酵70 h。

采用蒸馏法和HPLC法对发酵液的乙醇浓度进行了测定，以安琪酵母生产乙醇的实验测定结果为对照，每批实验Z. mobilis增产结果如表6所示。

3  结束语

采用安琪超级酿酒干酵母为对照，使用重组Z. mobilis，本实验分别以水稻和木薯为原料进行了多批乙醇发酵，综合化学检测和液相检测结果分析，可得出如下结论：

1）Z. mobilis乙醇发酵的指数期大约在0～40 h。菌种活化期间不需要添加任何外来氮源也可以高产乙醇。Z. mobilis发酵过程失重少，对安菌泰和青霉素有较强的耐受性。

2）以水稻或者木薯为原料发酵，Z. mobilis的乙醇发酵效果明显比安琪发酵效果更好，产酒量更高，淀粉出酒率和淀粉利用率更高。

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基金项目： 广西重点研发计划，多元原料高效生产燃料乙醇关键技术与产业化应用示范（项目编号：桂科AB192245049）。

收稿日期： 2020-05-31

作者简介： 李北（1963-），男，北京市人，高级工程师，硕士研究生，1997年毕业于对外经济贸易大学工商管理专业，研究方向：生物质能源及资源化利用开发。E-mail：1827798776@163.com。

通讯作者： 汪浩勇（1964-），男，教授，博士研究生。E-mail：371809000@qq.com。