参苓白术散中甘草黄酮和人参皂苷测定及抗氧化实验

2020-08-23王悦王娅玲邹婧张昊葳梁峰源高世杰

当代化工 2020年7期

王悦　王娅玲　邹婧　张昊葳　梁峰源　高世杰

摘要：采用高效液相法测定参苓白术散中人参皂苷和甘草黄酮的含量，为下一步探究参苓白术散的体外抗氧化活性研究做准备。方法：采用HPLC法（反相高效液相法），目的：为测定参苓白术散中的甘草黄酮、人参皂苷含量，进行线性范围的考察和实验方法学研究，同时测定参苓白术散中人参皂苷对羟自由基的抑制情况。结果：人参皂苷Rg₁、槲皮素、人参皂苷Re、芦丁分别在0.625～5.000 μg、0.250～1.000 μg、0.375～3.000 μg、0.250～1.000 μg 内对羟自由基的抑制作用显著;芦丁的平均质量分数为0.295 5 mg·g^-1;人参皂苷Rg₁的平均质量分数为0.193 mg·g^-1;槲皮素的平均质量分数为0.243 9 mg·g^-1;人参皂苷Re的平均质量分数为0.074 7 mg·g^-1。参苓白术散的抗氧化能力经验证也较为明显，人参皂苷对羟自由基的抑制率为79%。

关键词：高效液相法;参苓白术散;甘草黄酮;人参皂苷

中图分类号：TQ496 文献标识码：A 文章编号：1671-0460（2020）07-1301-04

Determination of Licorice Flavonoids and Ginseng Saponins

in Shenling Baizhu Powder and Antioxidant Tests

WANG Yue， WANG Ya-ling， ZOU Jing，ZHANG Haowei，LIANG Feng-yuan， GAO Shi-jie

（Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）

Abstract： The content of ginsenosides and licorice flavonoids in Shenling Baizhu Powder was determined by HPLC， which prepared for the further study of antioxidant activity of Shenling Baizhu Powder in vitro. Objective： to determine the content of liquorice flavonoids and ginsenosides in Shenling Baizhu powder by HPLC （reversed phase high performance liquid chromatography）. Methods： the linear range and experimental methods were investigated， and the inhibition of ginsenosides on hydroxyl free radicals was determined. Results： ginsenoside Rg1， quercetin， ginsenoside Re and rutin had significant inhibitory effects on hydroxyl radical in 0.625～5.000 μg， 0.250～1.000 μg， 0.375～3.000 μg and 0.250～1.000 μg， respectively; the average content of rutin was 0.295 mg·g-1; the average content of Ginsenoside Rg1 was 0.193 mg·g-1; the average content of quercetin was 0.2439 The average content of ginsenoside Re was 0.0747 mg·g-1. The antioxidant capacity of Shenling Baizhu Powder was also tested and proved to be more obvious， the inhibition rate of ginseng saponins to hydroxyl free radicals was 79%.

Key words： High-efficiency liquid phase method; Shenling Baizhu Powder; Licorice flavonoids; Ginseng saponins

參苓白术散，别名参术饮，具有补益脾胃的作用，可用于治疗食少便溏等症。高效液相法灵敏度高、出峰快，逐渐用于成分复杂的中药成分定性定量中^[1]，本次实验采用的是反相高效液相法测定参苓白术散中人参皂苷和甘草黄酮含量，并研究其有效成分对羟自由基的抑制效果。

近年来，探究参苓白术散方剂中的抗氧化活性成分一直是参苓白术散研究的热点，而相关研究也证明了参苓白术散方剂中皂苷及黄酮类化合物有较强的抗氧化作用，其含量直接影响了参苓白术散的抗氧化效果。但其含量测定的相关研究较少，HPLC法具有准确性好，灵敏度高的特点，因此我们拟建立一种利用HPLC法同时测定人参皂苷和甘草黄酮含量的方法，为下一步探究参苓白术散的体外抗氧化活性研究做准备。

1 实验

1.1 仪器

紫外-可见检测器;锥形瓶;移液枪;岛津SPD-16高效液相色谱仪紫外-可见检测器;FA1004N电子天平等。

1.2 药材与试剂

参苓白术散粉末;硫酸亚铁、铁氰化钾;人参

皂苷Re标准品、人参皂苷Rg₁标准品、芦丁标准品、槲皮素标准品均由中国医药上海化学试剂公司生产;实验用水为娃哈哈饮用水等。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

称取人参皂苷 Rg₁标准品25 mg，槲皮素对照品10 mg，人参皂苷Re标准品15 mg，芦丁标准品 10 mg溶解稀释，再定容，配成芦丁浓度0.2 mg·mL^-1、人参皂苷Rg₁0.5 mg·mL^-1、槲皮素0.2 mg·mL^-1、人参皂苷Re0.3 mg·mL^-1 的混合对照品溶液。

2.1.2 装柱

精密称取参苓白术散15 g，移液枪加入甲醇100 mL，密封，称定重量，回流3 h，放置至室温，称定重量，补足重量，抽滤，移取滤液50 mL，烘干，向剩余部分加5 mL 10%NaOH溶液，加25 mL娃哈哈水，分液漏斗分离4次，合并正丁醇，水洗2次，烘干，向残渣中加入适量娃哈哈水，通过大孔吸附树脂柱。洗脱，蒸干，通过微孔滤膜滤过。

2.2 参苓白术散中人参皂苷与甘草黄酮含量的测定

2.2.1 色谱条件的确定^[2]

选用MERCK PUROSPHER^?STAR C18色谱柱，梯度洗脱，流速为1.0 mL·min^-1;以乙腈—质量浓度为0.05%磷酸为流动相，每次确保色谱柱柱温为30 ℃;每次样品进样量为20 μL。

2.2.2 参苓白术散样品测定

分别精密称取参苓白术散样品5份，进样，出峰后记录数据，分别计算5份样品中指标成分的平均含量和RSD %。

2.2.3 线性范围的考察

分别精密吸取2.1.1项下混合对照品溶液，将溶液稀释至原来的1/2、1/4、1/6、1/8、1/16倍，按2.1色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图，绘制标准曲线。

2.2.4 实验精密度、稳定性与重复性的考察^[3]

精密吸取同一待测溶液，在所确定的HPLC条件下进样，并在出峰后记录数据; 再次通过精密吸取同一待测溶液，分别于2、 4、 8、 16、 24 h 测定;按上述方法，将参苓白术散待测样品5份，按如上方法制备，并进样分析，出峰后记录数据。

2.2.5 参苓白术散抗氧化实验

参照袁元实验方法^[4]，测定羟自由基的抑制率，

按照下列公式计算参苓白术散的抗氧化能力。

3 结果

3.1 4种标准曲线

如表1所示，经测定，芦丁的标准曲线：

Y=161 485x+10 336，R²=0.999 5;

槲皮素的标准曲线：

Y=74 887x-487.32， R²=0.999 9;

人参皂苷的标准曲线：

Rg₁ Y=354.4x-101.62， R²=0.999 1;

人参皂苷Re 的标准曲线：

Y=291.37x-89.992， R²=0.998 6 。

上述结果表明高效液相法测定参苓白术散中人参皂苷Rg、槲皮素、人参皂苷Re₁、芦丁的含量过程较为准确，4种线性方程如图1、图2、图3、图4所示。

3.2 高效液相法测定参苓白术散成分

分析高效液相指纹图谱可知，参苓白术散中甘草黄酮、人参皂苷与对照品的重合度为90%以上，进行5次重复实验，各组分含量计算如表2所示。

3.3 实验结果考察

如表3所示，对高效液相法测定参苓白术散槲皮素、人参皂苷Re、芦丁、人参皂苷Rg₁方法进行考察。

3.4 参苓白术散抗氧化结果

羟自由基为体内具有毒性作用的氧化剂^[5]，清除体内的羟自由基对遗传物质、多糖等具有一定的保护作用。由图5所示，实线部分为参苓白术散中的人参皂苷，虚线部分为对照品。人参皂苷对羟自由基的抑制率隨浓度增加而呈上升趋势，人参皂苷比对照品抗氧化能力更强，参苓白术散中人参皂苷对羟自由基的抑制率为79 %，对照品为64 %。

4 结论

梁少雄^[6]等通过指纹图谱确定参苓白术散中人参皂苷的含量所占比重较大，因此本实验采用高效液相法测定参苓白术散中的人参皂苷和甘草黄酮的含量^[7]。目前含量测定多采用吸光度法，通过测定回归方程计算含量。高效液相法灵敏度高、检测准确、技术成熟^[8]，不仅可以测定含量，还可以根据指纹图谱、峰面积确定成分^[9]。

人参皂苷是参苓白术散中的有效成分^[10]，分布在人参中，能够阻止肿瘤分化、调节心律失常、延缓衰老^[11]等，在改善记忆力、提高学习能力等方面作用显著^[12];甘草黄酮由甘草提取，能够改善肺部炎症、治疗结肠炎^[13]、减少神经系统损失^[14]等，临床应用广泛。

本实验采用高效液相法测定参苓白术散中人参皂苷的含量，进行线性范围的考察和实验方法学研究和药理实验^[15]。人参皂苷Rg₁、芦丁、槲皮素、人参皂苷Re分别在0.625～5.000、0.250～1.000、0.250～1.000、0.375～3.000 μg范围内显著;芦丁的平均质量分数为0.295 5 mg·g^-1;人参皂苷Rg₁平均质量分数是0.193 mg·g^-1; 槲皮素平均质量分数是0.243 9 mg·g^-1;人参皂苷Re平均质量分数是

0.074 7 mg·g^-1。参苓白术散的抗氧化能力经试验验证也较为明显，人参皂苷对羟自由基的抑制率为79%。本实验仅测定参苓白术散中人参皂苷和甘草黄酮的含量，其优化提取有待进一步研究^[16]。

参考文献：

[1]刘艳平，曾庆真.高效液相法在中药检验中的应用[J].世界最新医学信息文摘，2018，18（21）：149-149.

[2]谷民举，鞠建峰，朱宗敏，等.星点设计-效应面法优化荆芥穗黄酮类成分的提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（08）：29-33.

[3]王雪梅，李艳娇，宋燕青，等.基于高效液相指纹图谱检测参苓白术散中人参皂苷的含量测定[J].世界中医药，2018，13（11）：2876-287.

[4]马雯霞.高效液相色谱梯度洗脱法同时测定三七总皂苷中人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rg₁和三七皂苷R₁含量[J].中国药业， 2014， 23 （16）： 43-44.

[5]王燕新，廖园园，郭晓农，等.枇杷叶多糖提取及其体外抗氧化研究[J].西北民族大学学报（自然科学版），2019，40（4）：73-77.

[6]袁元，金河延，于洋，等. 白参、红参和黑参有效成分和抗氧化活性比较[J].延边大学农学学报，2019，41（4）：14-20.

[7]梁少雄.高效液相指纹图谱检测参苓白术散中人参皂苷的含量测定[J].按摩与康复医学，2019，10（22）：47-48.

[8]张娟娟，孙巍，王萍，等. 基于分析方法质量源于设计（AQbD）的复方丹参滴丸皂苷指纹图谱开发方法初步研究[J].中草药， 2017， 48 （19）： 3992-3997.

[9]张鹏，邬兰，李西文，等. 人参饮片标准汤剂的评价及应用探讨[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（7）：2-11.

[10]陈军辉，谢明勇，王慧琴，等.西洋参中人参皂苷类HPLC测定及其指纹图谱研究[J].食品科学，2005，26（11）：200-206.