土壤真菌Tolypocladium sp. HU35P-1次级代谢产物化学成分的研究

（辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110016）

真菌为土壤中的主要微生物，有分解有机质、为植物提供养分等功能。研究表明，土壤真菌的次级代谢产物种类繁多、资源丰富，有优越的药用活性，在发现新药及新的先导化合物研究中有广阔的前景[1-2]。从云南大围山土壤样品中分离得到一株真菌HU35P-1，通过体外抗肿瘤试验确定其具有较好的生物活性，依据菌落形态特征及ITS rDNA测序分析鉴定为Tolypocladiumsp. HU35P-1。为寻找新药的先导化合物，分离其次级代谢产物化学成分，得到3个化合物，根据其理化性质并综合运用波谱技术，鉴定这3个化合物分别为tolypyridone A（1）、尿嘧啶（uracil）（2）、3-甲基哌嗪2, 5-二酮（3）。其中，化合物1为首次从弯颈霉属中分离得到。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Bruker-ARX-400型核磁共振仪；Bruker AV-600 型核磁共振仪；Shimadzu LC-10ATvp型分析型高效液相色谱仪；Shimadzu LC-8A型制备型高效液相色谱仪；薄层色谱硅胶，柱色谱硅胶（青岛海洋化工）；Sephedex LH-20（瑞典Pharmacia Biotech公司）。

1.2 试药

甲醇，乙酸乙酯，丙酮（均为分析纯）；甲醇，乙腈（均为色谱纯）；氘代试剂（美国CIL公司）。

2 提取分离

取Tolypocladiumsp. HU35P-1的大米培养基500 g，将其捣碎，加入等体积的乙醇溶液（浓度95 %），浸泡、超声处理40 min，提取液减压浓缩，后放置通风处挥发。用等体积的乙酸乙酯溶液萃取3次，提取液减压浓缩，得到35 g乙酸乙酯萃取物，经硅胶柱色谱[二氯甲烷-甲醇（100:0→0:100梯度）]粗略洗脱分离，得到3个馏分，将3个馏分分别经过反复硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、制备HPLC色谱分离纯化，分别得到化合物1～3。

图1 化合物～3结构

3 结构鉴定

化合物1：淡黄色粉末（甲醇），254 nm紫外灯下明显暗斑，[α]20D：-77.3（c 0.5，MeOH），三氯化铁反应为阳性，推测存在酚羟基；1H-NMR（400 MHz， DMSO-d6）低场区有2个活泼氢质子信号：一个氮氢质子信号δH9.37（1H，br s， NH-1），一个酚羟基氢信号δH10.98（1H，br s，OH-7’）；δH7.20（2H，d，J=8.5 Hz，H-2’/6’）、6.70（2H，d，J=8.5 Hz，H-3’/5’）推测含一对二取代苯环片段，δH7.00（1H，s，H-6）为氮杂环上的氢信号；高场区显示3个叔碳上的甲基质子信号δH0.92（3H，d，J=6.3 Hz，H-16），1.03（3H，d，J=6.3 Hz，H-15），1.20（3H，d，J=6.0 Hz，H-14）；δH3.67（1H，m，H-13）为连氧碳上的氢。13C-NMR （100 MHz，DMSO-d6）谱中δc 129.8（C-2’），129.8（C-6’），114.8（C-3’），114.8（C-5’），125.0（C-1’），156.2（C-4’）为苯环上的碳信号，δc 162.8（C-4），162.3（C-2），130.3（C-6），113.1（C-5），111.0（C-3）为杂环上的碳信号，δc 22.9（C-15）、22.3（C-16）、18.8（C-14）为甲基碳信号，提示化合物为吡啶酮类生物碱。其圆二色谱（CD）谱图（图2）在200～225 nm区域显示强负cotton效应，在225～250 nm区域显示正cotton效应，与文献[3]报道完全一致，化合物1碳氢信号全归属见表1。以上数据与文献报道基本一致，故确定化合物1为tolypyridone A。

图2 化合物1的CD图谱

化合物2：棕色粉末（甲醇），254 nm紫外灯下没有暗斑存在，10 %（v/v）硫酸乙醇溶液不反应。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）谱中δH11.0 （1H，s，N-H），10.81（1H，s，N-H）为活泼酰胺氮氢质子信号，δH7.38（1H，d，J=6.0 Hz，H-6），5.44（1H，d，J=6.0 Hz，H-5），13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）谱中δC164.3（C-4），151.5（C-2），142.2（C-6），100.2（C-5）为嘧啶环上各个位置的信号。其碳氢数据与文献对照一致[4]，故确定化合物2为尿嘧啶。

化合物3：白色粉末（甲醇），254 nm紫外灯下没有暗斑存在。1H-NMR （400 MHz，DMSO-d6）谱中，δH8.15（1H，s，H-1），7.97（1H，s，H-2）为活泼氢质子信号；δH3.84（1H，q，J=7.0 Hz，H-3）为一次甲基氢质子信号，δH3.72（2H，s，H-6）为一亚甲基氢信号，δH1.25（3H，d，J=7.0 Hz，H-7）为甲基氢信号，以上数据与文献[5]对比一致，因此确定该化合物3为：3-甲基哌嗪2，5-二酮（3-methylpiperazine-2，5-dione）。

表1 化合物1的1H-NMR 和 13C-NMR数据（DMSO-d6）