芪精镇痛颗粒质量标准研究

张秋红，贾庆文

（1. 济南市食品药品检验检测中心，山东 济南 250102；2. 山东福瑞达医药集团有限公司，山东 济南250101）

芪精镇痛颗粒，是依据山东已故中医药名家周凤梧教授拟定的芪精镇痛汤[1]治疗气血亏虚型头痛的经验组方研制而成的制剂，目前为济南某医疗机构自制制剂，由炙黄芪、当归、茯苓、炙甘草、大枣、川芎、升麻等十味中药组成。经多年临床使用证明，该制剂在补气养血、疏风散痛等方面有较好疗效，临床上主要用于气血亏虚型头痛。原制剂质量标准简单，仅有当归、川芎的薄层色谱（TLC）鉴别和常规制剂通则项下的检查项目，缺少君药与其他药味的鉴别和含量测定，无法较全面控制制剂质量。为保证芪精镇痛颗粒质量满足疗效，同时符合山东省医疗机构制剂标准提高的要求，本实验从定性定量两个方面对该制剂进行全面研究，以期达到控制其质量的目的。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A高效液相色谱仪，SPD-20A检测器（日本岛津）； AE-100型电子天平（Mettler）；AE-240电子天平（Mettler）；WINCATS薄层照相系统（CAMAG）；硅胶G薄层板（Merck）；定量毛细管（美国Drummond公司）；HH-4数显恒温水浴锅（上海科恒）。

1.2 试药

黄芪甲苷对照品（批号：110781-201717），黄芪对照药材（批号：121462- 201705），升麻对照药材（批号：121182-201102），甘草对照药材（批号：120904- 201620），阿魏酸对照品（批号：110773-201915），异阿魏酸对照品（批号：111698-201904）均购自中国食品药品检定研究院。芪精镇痛颗粒（济南某医疗机构自制制剂，批号：20190108，20190110，20190201，20190210，20190301，20190310，20190401，20190410，20190501，20190510）。甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别[2]

2.1.1 炙黄芪[3]取本品颗粒3 g，加水5 ml使浸润，加入用水饱和的正丁醇30 ml，摇匀，超声10 min，滤过，滤液用氨试液洗涤2次，每次25 ml，取正丁醇液，蒸干，加甲醇1 ml溶解残渣，作为样品溶液。另取黄芪对照药材1 g，同法制成黄芪对照药材溶液。再取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的黄芪甲苷对照品液。取去除炙黄芪制得的芪精镇痛颗粒，按同法制成缺黄芪的阴性样品溶液。吸取上述黄芪甲苷对照品液2 µl，其余3种溶液各10 µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2）下层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷硫酸乙醇溶液（1→10），105 ℃加热显色。供试品色谱中，与对照品、对照药材相应位置上，显棕色至棕褐色斑点；紫外光（365 nm）下显橙黄色斑点。缺炙黄芪的阴性样品无干扰，结果见图1～2。

图1 炙黄芪的TLC图（日光下）

图2 炙黄芪的TLC 图（365 nm）

2.1.2 升麻[3-4]取本品颗粒3 g，加乙醇30 ml，水浴回流1 h，滤过，蒸干滤液，加乙醇1 ml溶解残渣，作为样品溶液。另取升麻对照药材1 g，同法制成升麻对照药材溶液。再取异阿魏酸对照品，制成每1 ml含1 mg的乙醇溶液，作为异阿魏酸对照品液。取去除升麻制得的芪精镇痛颗粒，按同法制成缺升麻的阴性样品溶液。吸取上述样品溶液15 µl、对照药材溶液、对照品液各2 µl、缺升麻的阴性样品溶液10 µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-冰醋酸（12:2:1）为展开剂，展开，取出，晾干，紫外光（365，254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点。缺升麻的阴性样品无干扰，结果见图3～4。

图3 升麻的TLC 图（365 nm）

图4 升麻的TLC图（254 nm）

2.1.3 炙甘草[3]取本品颗粒3 g，加乙醚40 ml，回流1 h，滤过，弃去乙醚液，残渣加甲醇30 ml，回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水40 ml使溶解，再用水饱和的正丁醇20 ml萃取3次，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，取正丁醇液蒸干，加甲醇5 ml溶解残渣，作为样品溶液。另取甘草对照药材1 g，同法制成甘草对照药材溶液。取去除炙甘草制得的芪精镇痛颗粒，按同法制成缺炙甘草的阴性样品溶液。吸取上述3种溶液各5 µl，分别点于同一用1 % NaOH制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15:1:1:2）为展开剂，展开，取出，晾干。喷硫酸乙醇（1→10）液，105 ℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在对照药材色谱相应的位置上，显相同的3个黄色斑点；紫外光（365 nm）下检视，显相同的6个荧光斑点。缺炙甘草的阴性样品无干扰，结果见图5～6。

图5 炙甘草的TLC 图（日光）

图6 炙甘草的TLC图（365 nm）

2.2 HPLC含量测定[2]

2.2.1 色谱条件 岛津 Wondasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相乙腈-0.1 %磷酸溶液（1:9）；检测波长321 nm；流速1.0 ml/min；柱温30 ℃；进样量10 µl。理论板数按阿魏酸计应不低于4800。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液制备 精密称取阿魏酸对照品、异阿魏酸对照品适量，加70 %甲醇制成每1 ml含阿魏酸、异阿魏酸各20 µg的混合溶液，即得。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 取芪精镇痛颗粒细粉约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70 %甲醇25 ml，密塞，称定重量，回流30 min，放冷，用70 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2.3 阴性样品溶液的制备 处方中去除当归、川芎、升麻、酸枣仁后制成芪精镇痛颗粒含量测定用阴性样品, 并按2.2.2.2项制备方法制成含量测定用阴性样品溶液。

2.2.3 专属性试验 分别吸取上述3种溶液各10 µl，注入液相色谱仪，混合对照品、供试品及阴性样品色谱见图色谱图见图7～9。表明该方法专属性良好。

图7 对照品溶液的HPLC图

图8 芪精镇痛颗粒样品溶液的HPLC图

图9 芪精镇痛颗粒含量测定阴性样品溶液的HPLC图

2.2.4 线性关系考察 精密吸取阿魏酸、异阿魏酸混合对照品溶液（阿魏酸20.2 µg/ml，异阿魏酸20.4 µg/ml）2，5，10，20，40 µl，按2.1.1项下方法分别注入液相色谱仪，测定峰面积。分别以阿魏酸进样量（µg）为横坐标，峰面积为纵坐标；以异阿魏酸进样量（µg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘得标准曲线。阿魏酸的回归曲线方程为Y=5.31×103X+7.90×102，r=1.0000；异阿魏酸的回归曲线方程为Y=4.84×103X+1.71×103，r=1.0000。结果表明，阿魏酸在40.4～808 ng（r= 1.0000）范围内线性关系良好，异阿魏酸在40.8～816 ng（r=1.0000）范围内线性关系良好。

2.2.5 稳定性试验 精密吸取批号为20190510的供试品溶液10 µl，室温下分别于0，2，6，12，18，24 h，注入色谱仪，测定阿魏酸、异阿魏酸峰面积，计算RSD，分别为1.09 %（n=6），1.67 %（n=6）。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好，不影响阿魏酸与异阿魏酸成分的测定。

2.2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 µl，注入色谱仪，测定阿魏酸异阿魏酸峰面积，连续测定6次，计算RSD，分别为0.17 %（n=6），1.28 %（n=6）。表明仪器的精密度良好。

2.2.7 重复性试验 称取同一样品（批号20190201）6份，每份约1 g，精密称定，按2.2.2.2项方法制成供试品溶液，每份精密吸取10 µl，注入液相色谱仪，测定阿魏酸、异阿魏酸的含量，计算RSD，结果分别为1.00 %（n=6），1.85 %（n=6）。表明方法的重复性良好。

2.2.8 加样回收试验 取含阿魏酸0.4683 mg/ml，含异阿魏酸0.2504 mg/ml的芪精镇痛颗粒（批号20190201）12份，研细，6份精密称取约0.5 g加入阿魏酸对照品溶液（20.2 µg/ml）10 ml，6份加入异阿魏酸对照品溶液（20.76 µg/ml）10 ml。按2.2.2.2项方法制成不同的12份供试品溶液，按2.2.1项色谱条件，注入液相色谱仪，测定阿魏酸、异阿魏酸峰面积，计算回收率。两个成分的RSD均未超过2.0 %，表明该方法准确性良好。见表1。

2.2.9 样品含量测定 称取样品粉末各约1 g，精密称定，制成供试品溶液，分别精密吸取10 µl，注入色谱仪，测定阿魏酸、异阿魏酸含量，结果见表2。

表1 加样回收试验结果

表2 芪精镇痛颗粒中阿魏酸、异阿魏酸含量

10批样品含量测定结果均大于0.75 mg/g，根据测定结果规定本品每1 g含阿魏酸（C21H20O9）与异阿魏酸（C21H20O9）的总量不得少于0.45 mg。

3 讨论

3.1 TLC鉴别的讨论

3.1.1 炙黄芪 3种提取方法均可用于炙黄芪定性，但用超声法提取的供试品溶液杂质多，底色较深，且原点附近有黑色斑点拖尾严重；用中性氧化铝柱提取的供试液，能有效除去糖类及脂溶性的干扰。但由于方中所含药物较多，成分复杂，故无效斑点亦较多。而用碱性溶剂（氨水）提取的供试品溶液能有效去除阿魏酸[5]、异阿魏酸、甘草酸等酸性成分，氨水洗涤的另一重要作用是将其他黄芪皂苷类成分转化为黄芪甲苷，提高黄芪甲苷的含量，有利于测定。结果表明，色谱分离效果更好，色谱斑点清晰，无干扰，黄芪甲苷斑点的Rf值约为0.42～0.52。综合考虑，用氨水洗涤法是最简便可行的提取方法。但预饱和后仍有较为明显的边缘效应，需进一步查找原因找出可行方法减少边缘效应影响。

3.1.2 升麻 在此实验中，以苯-三氯甲烷-冰醋酸（12:2:1）为展开剂进行展开，但在薄层板上出现展开剂前沿分层，考虑到所购的预制板结构不稳定，会影响展开效果；且展开剂本身极性不同，存在分层。综合考虑，将预制板先放入展开剂中空跑一遍，晾干，再作为展开板使用，效果可靠、明显。结果表明，经筛选优化后的条件，用于升麻的TLC鉴别，其分离效果好，斑点边缘清晰、圆整，不扩散，无拖尾，无边缘效应，可用于芪精阵痛颗粒中升麻的TLC定性鉴别分析。

3.1.3 炙甘草 炙甘草的TLC图谱显示，处方中其他成分及辅料均无干扰。该方法专属性强，重现性好，灵敏度高，且阴性无干扰，可用于芪精镇痛颗粒的质量控制。

3.2 HPLC含量测定的讨论

3.2.1 含量测定中供试品溶液的制备 分别采用70 %甲醇溶液、70 %乙醇溶液、50 %乙醇溶液、10 %乙醇溶液，10 %乙醇和70 %甲醇制备供试品溶液，测得含量相差不大，但过滤困难。以50 %乙醇、70 %乙醇溶液和70 %甲醇溶液为溶剂制备供试品溶液，测得含量差异较大，且50 %乙醇溶液过滤困难。综合考虑，最终选用70 %甲醇作为供试品溶剂。

3.2.2 阴性对照品制备 参照文献[5-8]，当归、川芎、升麻、酸枣仁含所测成分，故选用剩余五味中药按处方工艺制备阴性对照品。

3.2.3 检测波长选择 根据阿魏、异阿魏酸在70 %甲醇溶液中的紫外吸相关文献[4,9-17]，选择321 nm为检测波长。

3.2.4 流动相的选择 首先选用甲醇-1 %醋酸溶液（30:70），但阿魏酸、异阿魏酸达不到分离效果。后改变甲醇-1 %醋酸溶液比例（13:87），异阿魏酸分离效果不好，后选用乙腈-0.1 %磷酸溶液（13:87）作为流动相，异阿魏酸分离效果不好，后选用乙腈-0.1 %磷酸溶液（13:87），结果表明，阿魏酸、异阿魏酸分离效果良好，故选用乙腈-0.1 %磷酸溶液（13:87）为流动相。

3.2.5 含量测定结果分析 本实验建立了HPLC同时测定2种成分阿魏酸、异阿魏酸的含量，该方法精密度良好，灵敏度高，专属性好，可用于芪精镇痛颗粒中阿魏酸、异阿魏酸的含量测定。

综上，建立的质量标准方法简便可行，使芪精镇痛颗粒的质量得到有效控制。