川芎嗪对坏死性小肠结肠炎新生大鼠保护作用的研究

吴婷婷 张星 马英 李娟 李今 李华

1榆林市第一医院新生儿科719000；2榆林市第一医院PETCT中心719000；3西安市儿童医院新生儿科710003；4西安市儿童医院病理科710003；5西北妇女儿童医院乳腺外科，西安710000；6西安交通大学医学院基础学院710000

0 引言

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是临床最常见的新生儿消化道疾病之一，不及时有效治疗可引发感染性中毒、败血症、呼吸衰竭及肠穿孔，严重时可导致患儿死亡，对新生儿的生命与生存质量均造成了严重影响[1-2]。目前，临床对于NEC的主要治疗原则为抗炎、改善肠道微循环及肠道菌群等，但尚无特效治疗方法[3]。诸多研究结果表明，中药及现代化中药制剂对NEC具有较好疗效。其中川芎嗪是一种临床常用的中药单体成分，主要提取自伞形科植物川芎根茎，具有抗炎、改善微循环、扩张血管等多种药理作用[4]。部分临床研究结果显示，川芎嗪对溃疡性结肠炎等肠道疾病具有较好的疗效，但用于NEC的治疗尚无报道[5]。鉴于川芎嗪具有治疗NEC的药理基础，且在肠道疾病治疗方面具有一定的临床基础，笔者采用缺氧冷应激联合配方奶侵袭性喂养法建立NEC新生大鼠模型，探讨川芎嗪对NEC新生大鼠的保护作用，以期为NEC的治疗及川芎嗪的临床应用提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

磷酸川芎嗪胶囊（批号2017011124，甘肃省西峰制药有限责任公司），强化配方乳、丙二醛检测试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒、小鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（cysteine aspartic acid specific protease-3，caspase-3）抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体（美国Sigma公司）。

出生48 h内的健康无特定病原体级新生Sprague-Dawley大鼠 50 只，体质量为（200±20）g，雌雄不限，购于西北农林科技大学实验动物中心，许可证号SCXK（陕）2017-0004。饲养条件为温度18～28℃，相对湿度55%，自由进食饮水，日常光照。本研究所有的动物实验均获得榆林市第一医院实验动物福利伦理委员会批准。

TB-P1生物组织自动包埋机（上海三崴医疗设备有限公司），TD5多管架自动平衡高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司），ZG-680酶标仪（无锡集佳智能科技有限公司），TH4-200光学显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物给药剂量

按成人剂量的6.25倍计算大鼠给药剂量。其中成人体质量以60 kg计，则磷酸川芎嗪胶囊的人体正常剂量应为：50 mg/60 kg=0.83 mg/kg。再进一步按照公式计算可得出每天每只新生大鼠的给药剂量为：6.25×0.83 mg/kg=5.18 mg/kg，并以 2.09 mg/kg为低剂量，5.18 mg/kg为中剂量，10.36 mg/kg为高剂量。

1.2.2 实验动物分组、造模及给药方法

将出生48 h内的健康新生Sprague-Dawley大鼠50只按照随机数字表法分为空白组、模型组、低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组10只。除空白组外，其他各组新生大鼠均采用缺氧冷应激联合配方奶侵袭性喂养法建立NEC模型，即将新生大鼠与母鼠分离，每天 9∶00、13∶00、17∶00 及 21∶00 分别采用强化配方乳经口插管喂养1次，每次0.15 ml，1 d后增至每次0.20 ml；并于每天9∶00给予4℃寒冷刺激10 min，21∶00给予缺氧刺激（氧气体积分数＜2%的氮气）90 s；每天9∶00缺氧冷应激与强化配方乳经口插管喂养结束后，对低、中、高剂量组新生大鼠进行插管给药，川芎嗪的给药剂量分别为2.09、5.18、10.36 mg/kg，连续给药3 d；模型组给予等体积的氯化钠注射液；空白组则不予任何处理，均由哺乳期母鼠代乳。

1.2.3 标本处理及观察指标

末次人工喂养12 h后，采用颈椎脱臼法处死各组大鼠，分离回盲部肠组织，并于距回盲部4 cm范围内剪取长度约3 cm的全层回肠末端组织，平均分为3份。

取其中1份回盲部肠组织，利用玻璃匀浆器将其制成组织匀浆液，采用硫代巴比妥酸比色法检测匀浆液中的丙二醛和CAT水平，双位点夹心酶联免疫吸附法检测匀浆液中的GSH-Px和SOD水平。另取1份回盲部肠组织，依次经质量分数为4%的多聚甲醛固定、石蜡包埋及切片处理，采用苏木精-伊红染色观察回盲部肠组织的病理学变化，并采用Khailova标准进行回盲部肠组织损伤评分，其中0分为回盲部肠组织结构正常，且绒毛及上皮均完整；1分为回盲部肠组织黏膜固有层轻微肿胀分离；2分为回盲部肠组织黏膜固有层中度肿胀分离；3分为回盲部肠组织黏膜固有层重度肿胀分离，黏膜下肌层水肿并伴局部绒毛脱落；4分为肠坏死伴回盲部肠组织绒毛消失。取剩余回盲部肠组织，根据免疫组化相关方法，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法依次进行石蜡切片脱蜡、水化、抗原修复、一抗结合、二抗结合、二氨基联苯氨显色、苏木素复染、乙醇脱水、二甲苯透明及封片处理，观察caspase-3蛋白表达情况（阳性表达为棕褐色），并进行半定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS22.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均值±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 川芎嗪对NEC新生大鼠回盲部肠组织匀浆中氧化应激指标的影响

由表1可知，与模型组相比，低、中、高剂量组新生大鼠回盲部肠组织匀浆中的丙二醛水平均明显降低，而CAT、GSH-Px和SOD水平均明显升高，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）；与空白组相比，低、中、高剂量组新生大鼠回盲部肠组织匀浆中的丙二醛水平均明显升高，而CAT、GSH-Px和SOD水平均明显降低，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 各组新生大鼠回盲部肠组织匀浆中氧化应激指标变化（Mean±SD，n=10）

2.2 川芎嗪对NEC新生大鼠回盲部肠组织病理学变化的影响

苏木精-伊红染色结果显示，空白组新生大鼠回盲部肠组织结构均正常，肠上皮与绒毛均较为完整（图1A）；模型组新生大鼠肠绒毛参差不齐，腺体排列紊乱，部分绒毛脱落及坏死，回盲部肠组织严重坏死，黏膜固有层重度肿胀分离，肌层严重变薄（图1B）；低、中、高剂量组新生大鼠伴有肠绒毛轻中度充血水肿及回盲部肠组织黏膜固有层轻中度肿胀分离，但程度均不及模型组（图1C～1E）。进一步采用Khailova标准进行回盲部肠组织损伤评分，结果显示，空白组、模型组、低剂量组、中剂量组及高剂量组的回盲部肠组织损伤评分分别为（0.12±0.01）、（3.21±0.43）、（1.91±0.33）、（1.56±0.31）及（1.35±0.26）分。与模型组相比，空白组及低、中、高剂量组的回盲部肠组织损伤评分均明显降低，差异均具有统计学意义（均 P＜0.05）；与空白组相比，低、中、高剂量组的回盲部肠组织损伤评分均明显升高，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

2.3 川芎嗪对NEC新生大鼠回盲部肠组织中caspase-3蛋白表达的影响

免疫组化染色结果显示，caspase-3蛋白在空白组新生大鼠回盲部肠组织中仅见微量表达，在模型组呈棕黄色强阳性表达，而在低、中、高剂量组阳性表达均明显减弱（图2）。半定量分析结果显示，与模型组（9.34±0.98）相比，空白组及低、中、高剂量组回盲部肠组织中的caspase-3蛋白相对表达量（1.00±0.00、5.51±0.57、4.46±0.45、2.15±0.21）均明显降低，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

图1 苏木精-伊红染色观察各组新生大鼠回盲部肠组织的病理学变化

图2 免疫组化染色观察各组新生大鼠回盲部肠组织中caspase-3蛋白的表达

3 讨论与结论

NEC是早产儿的常见胃肠道疾病之一，具有发病率高、病死率高及治疗难度大等特点[6]。目前，NEC的发病机制尚未完全清楚，但公认的可能病因有细菌定植、先天性免疫异常、炎症反应、肠道组织发育不成熟、肠道缺血缺氧及不当喂养等[7-8]。近年来有研究结果表明，多种因素引起的肠道细胞凋亡等肠道屏障损坏，以及由此造成的系统性败血症及肠道菌群转移所致的继发性氧化应激损伤可能是造成NEC的最主要病因之一，故抑制肠道细胞凋亡、改善肠道氧化应激紊乱对于治疗NEC具有重要意义[9-10]。

川芎嗪是从伞形科藁本属植物川芎根茎中提取分离的一种生物碱单体，具有抗炎、抑制细胞凋亡、抗氧化应激、改善微循环、扩张血管等多种活性[11]。川芎嗪还可激活肠道激肽系统，扩张肠道毛细血管，从而改善回盲部肠组织的微循环[12]。此外，川芎嗪还能有效改善肠道局部炎症，抑制肠道炎症因子的合成与释放[13]。为此，本研究采用缺氧冷应激联合配方奶侵袭性喂养法建立NEC新生大鼠模型，探讨了川芎嗪对NEC新生大鼠的保护作用，这对于扩展NEC的应用范围及NEC的新药研发均具有重要意义。

Caspase是一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡过程中具有重要作用，其中caspase-3为caspase家族的重要蛋白，能有效且特异性反映细胞凋亡情况[14]。有文献报道，在药物改善NEC所致回盲部肠组织损伤的同时，caspase-3蛋白表达明显降低，亦证实了caspase-3蛋白是调节肠道细胞凋亡的关键酶[15]。丙二醛、CAT、GSH-Px和SOD均为机体的重要氧化应激指标，其中丙二醛是细胞膜脂质过氧化的重要产物之一，其产生还可加剧细胞膜的损伤；CAT和GSH-Px主要用于催化机体中过氧化物酶的分解，从而减轻有机氢过氧化物对正常机体的损伤，对维持机体细胞膜功能亦具有重要意义；而SOD为人体内重要的自由基清除剂，可通过清除氧自由基来改善脂质过氧化[16-18]。

在本研究中，与模型组相比，低、中、高剂量组回盲部肠组织匀浆中的丙二醛水平均明显降低，而CAT、GSH-Px和SOD水平均明显升高，提示川芎嗪能有效改善NEC所致肠道氧化应激紊乱，这对于改善氧化应激所致局部损伤具有重要意义。苏木精-伊红染色和免疫组化染色结果显示，低、中、高剂量组肠绒毛充血水肿及回盲部肠组织黏膜固有层肿胀分离程度均不及模型组，且回盲部肠组织损伤评分、回盲部肠组织中caspase-3蛋白阳性表达均明显低于模型组，表明川芎嗪能减轻NEC所致回盲部肠组织损伤，抑制肠道细胞凋亡，这可能是川芎嗪对NEC具有保护作用的主要机制之一。由于文献较为缺乏等原因，本研究对于川芎嗪具体作用机制的探讨仍不明确，后期还需深入讨论。此外，本研究仅考察了川芎嗪对于NEC新生大鼠肠道氧化应激以及caspase-3蛋白表达的影响，对于川芎嗪是否通过其他途径改善NEC所致肠道损伤则未进行阐述，有待于在后续研究中予以完善。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突