CCNB2作为潜在生物标志物在肾透明细胞癌组织中的表达及临床意义

李伯全 康胜虎 王蕊

中国人民解放军联勤保障部队第983医院泌尿外科，天津300142

0 引言

肾细胞癌（肾癌）是常见的泌尿系统恶性肿瘤，其约占成人癌症病例的3%[1-2]。统计结果显示，每年约有20.9万新发肾癌病例和10.2万因肾癌死亡病例[3]，其中初诊即被诊断为转移性肾癌的患者约占30%。一旦肾癌进入转移期，其治疗就非常困难，因此这类患者的5年生存率普遍较低[4-5]。

肾透明细胞癌约占所有肾癌的80%，其对放射治疗（放疗）和化学治疗（化疗）均不敏感[6]，手术治疗仍然是其主要治疗手段，但手术后的复发率约33%[7]。因此，有必要针对肾透明细胞癌的基因靶点展开研究，以便为肾透明细胞癌的靶向治疗提供依据。

细胞周期蛋白 B2（cyclin B2，CCNB2）与 CCNB1均为细胞周期蛋白B族的重要成员，在调节细胞周期方面发挥重要作用[8]。CCNB1和CCNB2在不同分裂期细胞定位方面存在很大差异：在分裂间期，CCNB1定位于微粒体，CCNB2则定位于高尔基体；在分裂期，CCNB1定位于细胞核，CCNB2则分散在细胞中[9-10]。多项研究结果表明，CCNB2参与肿瘤的进展。因此，对CCNB2开展研究有望揭示肿瘤发病的一些分子机制[11]。CCNB2参与很多肿瘤的发生和发展，如非小细胞肺癌、乳腺癌等[11-12]，其中患者的CCNB2表达水平明显升高[13-14]。

目前，关于CCNB2在肾透明细胞癌发展中的相关功能和分子机制的研究较少，本研究中主要研究肾透明细胞癌患者CCNB2的mRNA在肿瘤组织与癌旁正常组织中的表达，分析CCNB2与肾透明细胞癌患者的临床病理特征之间的关系，并研究CCNB2蛋白表达水平与肾透明细胞癌患者的预后生存之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2010年10月至2019年12月，中国人民解放军联勤保障部队第983医院泌尿外科收治的经手术治疗的肾透明细胞癌患者98例。其中，男性54例，女性44例，年龄（53.2±9.8）岁。全部病例均经过临床病理证实，并具有完整的病例资料。收集患者的肿瘤组织和相应的癌旁正常组织样本。临床病理特征包括患者性别、年龄、肿瘤分期、肿瘤分级、肿瘤大小。根据AJCC-TNM-2010分类系统和WHO/ISUP-2016系统分别评估肿瘤分期和分级[15-16]。本研究以1964年赫尔辛基宣言和随后所有修订案中规定的道德标准为基础，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 主要材料与仪器

山羊血清封闭液、免疫组化二抗试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），3，3'-二氨基联苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）（美国 Cell Signaling Technology公司）。

RM2235型石蜡切片机（德国Leica公司），BX51型显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.2.2 免疫组织化学检测

所有的组织切片经福尔马林固定，石蜡包埋，4℃切片保存。将组织切片放入60℃的烘箱中30 min；然后将切片先后浸入二甲苯罐处理3次，每次10 min；梯度乙醇溶液水化处理5次，每次5 min；将处理过的切片用蒸馏水冲洗5 min，然后用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤 5 min，重复2次；将切片浸泡在体积分数为3%的H2O2溶液中10 min；PBS洗涤3次；将切片放入修复液，煮沸至120℃，5 min后冷却至室温，以修复抗原；将山羊血清滴加到组织块上，室温封闭50 min；根据切片上组织的大小加入一抗，室温孵育1 h；PBS洗涤4次，每次5 min；吸取适量二抗滴加于组织切片上，孵育40 min；PBS洗涤4次，每次5 min；滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）后，孵育 40 min；PBS 冲洗 4 次，每次 5 min；滴加DAB显色液，显色3 min，冲洗，并用适量苏木精复染；将组织切片用梯度乙醇溶液处理（80%、11 s，90%、11 s，100%、6 min、100%、6 min）；将切片浸入二甲苯中处理3次，每次5 min；用中性树胶进行封片，晾干；用显微镜观察并采集图像。

组织中出现棕黄色颗粒，则认为该组织为阳性染色，随机选取5个不同的视野，依照阳性细胞着色面积及强度进行评定。阳性细胞着色面积评分标准：阳性细胞着色面积＜10%，记0分；着色面积在10%～25%时，记1分；着色面积在26%～75%时，记2分；着色面积＞75%时，记3分。阳性染色强度评分标准：阴性染色记0分；弱阳性染色记1分；中阳性染色记2分；强阳性染色记3分。以阳性细胞着色面积评分和染色强度评分之和判断表达情况，结果＜5分，为低表达；结果≥5分，为高表达。

1.2.3 临床样本生物信息学分析

通过基因表达谱交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）数据库获取临床样本615例，其中包括515例肾透明细胞癌组织样本和100例癌旁正常组织样本。通过GEPIA数据库分析CCNB2的mRNA在肾透明细胞癌组织和癌旁正常组织中的差异。数据库的网址为http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=CCNB2。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0软件处理数据。计量资料采用均值±标准差（Mean±SD）表示；组间比较采用学生t检验；利用χ2检验分析临床病理特征与蛋白表达的关系；生存分析采用Kaplan-Meier法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析结果

为了更好地阐明CCNB2在肾透明细胞癌组织中的作用，通过GPEIA分析CCNB2的mRNA在肾透明细胞癌组织和正常组织中的表达情况，共分析肾透明细胞癌组织515例及正常组织100例。结果表明，CCNB2的mRNA在肾透明细胞癌组织中显著高表达（图1），表明CCNB2参与肾透明细胞癌的发展。为了进一步研究CCNB2的表达与肾透明细胞癌患者长期预后的关系，利用Kaplan-Meier曲线分析了CCNB2在肾透明细胞癌患者预后中的作用。结果表明，CCNB2表达较低的患者中，总生存率和无病生存率都较高（图2A和图2B）。结果提示，CCNB2的表达与肾透明细胞癌患者的生存期具有显著的相关性，提示CCNB2的异常表达可能与肾透明细胞癌患者的不良预后相关（图2）。

2.2 CCNB2在肾透明细胞癌组织中的表达

免疫组化结果显示，CCNB2在肾透明细胞癌组织中高表达（图3A），而在癌旁正常组织中CCNB2的表达显著降低（图3B），这表明CCNB2可能影响肾透明细胞癌的生长和发展。根据染色强度，将肾透明细胞癌患者分为CCNB2高表达组和CCNB2低表达组。

2.3 CCNB2蛋白表达水平与肾透明细胞癌患者的临床病理特征的相关性

为了阐明CCNB2在肾透明细胞癌进展中的作用，分析比较了CCNB2高表达组和CCNB2低表达组患者的临床病理特征差异，包括年龄、性别、肿瘤分期、肿瘤分化程度、肿瘤体积。分析结果表明，CCNB2表达水平与肿瘤分期（P=0.039）和肿瘤大小（P=0.001）显著相关，而与年龄（P＞0.05）、性别（P＞0.05）、肿瘤分级（P＞0.05）的相关性无统计学意义。（表 1）

3 讨论

肾细胞癌仅次于膀胱癌，是发病率第二位的泌尿系统恶性肿瘤，其中80%以上病例为肾透明细胞癌[17-18]。目前，手术作为肾透明细胞癌的主要治疗手段，其复发率高，且存在很大的局限性。因此，为了开展针对肾透明细胞癌的靶向治疗，有必要进对肾透明细胞癌的相关作用蛋白展开研究[19-20]。

图1 肾透明细胞癌组织中细胞周期蛋白B2（CCNB2）的mRNA表达

图2 细胞周期蛋白B2表达与肾透明细胞癌患者生存率的相关性

图3 肾透明细胞癌组织和癌旁正常组织中CCNB2的免疫组化结果

表1 CCNB2蛋白表达与肾透明细胞癌患者临床病理特征的相关性分析

CCNB1主要通过G2/M过渡发挥作用，其通过触发蛋白质磷酸化来调控有丝分裂早期活动，还可通过调节染色体分离酶的活动在有丝分裂后期发挥作用[21-22]。而CCNB2参与多种肿瘤的发展进程，在非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌等多种癌症中有重要作用[23-24]。但目前，CCNB2在肾透明细胞癌中的作用机制及临床预后等方面尚不清楚。本研究中，通过GEPIA数据库分析了515例肾透明细胞癌组织样本和100例癌旁正常组织样本。结果表明，与癌旁正常组织相比，肾透明细胞癌组织CCNB2的mRNA表达水平明显升高。

Shubbar等[25]的研究结果表明CCNB2表达水平越高，乳腺癌患者的生存期越短，且通过多因素分析证实了胞浆中CCNB2蛋白表达水平是患者生存期的独立预后因素。Takashima等[11]则发现肺癌患者的生存期与CCNB2的mRNA表达水平呈明显的负相关关系。本研究的结果显示，对于肾透明细胞癌患者，CCNB2表达程度越高，其总生存率和无病生存率越低。

对CCNB2蛋白与肾透明细胞癌患者的临床病理特征的分析结果表明，CCNB2表达水平与肿瘤分期、肿瘤大小显著相关（均P＜0.05），但与性别、年龄、肿瘤分级无关（均P＞0.05）。提示可采用CCNB2表达量来预测肿瘤的恶性程度。

综上，CCNB2参与肾透明细胞癌的发展进程，且在肿瘤发展中扮演十分重要的作用。CCNB2高表达，则预示肾透明细胞癌患者的不良预后，且其与肿瘤分期、肿瘤大小有关。可以认为，CCNB2有望成为肾透明细胞癌诊断、治疗及预后的潜在靶点。下一步，将通过动物实验来深入探讨CCNB2在肾透明细胞癌发展、转移等方面的分子机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突