表没食子儿茶素没食子酸酯对糖尿病大鼠神经病理性疼痛的改善作用

刘文雄 陈 波

(陕西省西安市西电集团医院麻醉科，西安市 710077，电子邮箱：2920695983@qq.com)

糖尿病神经病理性疼痛是临床上糖尿病最常见的并发症之一，约有50%的糖尿病患者患有不同程度的神经病理性疼痛症状[1-2]。糖尿病神经病理性疼痛的主要临床表现为自发性和诱发性的疼痛以及痛觉的过敏和超敏，严重者可继续发展为糖尿病足甚至截肢；同时，疼痛可长期影响糖尿病患者的睡眠质量和精神状态，降低糖尿病患者的生活质量[3-4]。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是绿茶提取物绿茶多酚成分中含量最多的组分。既往大量研究显示，EGCG具有较强的抗氧化和抗肿瘤效应[5-6]，亦具有显著的抗炎效应，能够显著下调炎性相关因子的表达和分泌，包括白细胞介素(interleukin,IL)-1β、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、IL-8以及巨噬细胞趋化因子等[7-8]。最近，有学者发现EGCG具有一定程度的镇痛效果[9-10]。但是，EGCG能否缓解糖尿病神经病理性疼痛症状，迄今国内外尚未见文献报道。本实验通过腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)构建速发性糖尿病动物模型，分析不同浓度的EGCG对糖尿病神经病理性疼痛的缓解效果，以及对大鼠脊髓p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和IL-1β基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体级雄性SD大鼠50只，均为3月龄，体重280～295 g，购于中国人民解放军空军军医大学实验动物中心(许可号：20160209)。全部大鼠自由进食饮水，适应恒温(23±1)℃、恒湿(湿度50%～60%)的实验室环境1周。

1.2 实验试剂和主要仪器 STZ溶液(批号：V900890)、戊巴比妥钠溶液(批号：P-010)均购于美国Sigma公司；EGCG购于美国APExBIO公司(批号：A2600)。cDNA反转录试剂盒购于北京天根生物技术公司(批号：KR106)，Maxima®SYBR Green qPCR试剂盒购于美国Thermo Fisher Scientific公司(批号：K0221)，RNA提取试剂TRIzol购于美国Invitrogen公司(批号：15596018)。荧光定量PCR仪购自Bio-Rad 公司(型号：CFX96)。便携式血糖测试分析仪购于美国LifeScan公司(型号：ONE-TOUCH)。Von Frey纤维丝购于美国Stoelting公司(批号：52735)。热痛敏刺激和测量系统购于意大利Commat公司(型号：May AHP 0603)。

1.3 分组及动物模型构建方法 所有大鼠根据体重，按随机区组设计分为对照组、糖尿病组、10 mg/kg EGCG组、50 mg/kg EGCG组和100 mg/kg EGCG组，每组10只。除对照组外，其余4组大鼠通过腹腔注射STZ溶液(55 mg/kg)构建胰岛素依赖糖尿病动物模型，对照组大鼠腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液。注射72 h后通过血糖测量仪检测各组大鼠随机血糖值，注射STZ溶液的所有大鼠随机血糖值均高于14.0 mmol/L，并表现出多饮、多食、多尿的“三多”特征，符合糖尿病建模标准。随后3个 EGCG组大鼠给予相应剂量的EGCG灌胃，其他两组大鼠给予相同体积的生理盐水灌胃处理，均1次/d，连续灌胃8周。于开始给予EGCG处理后的第4周和第8周，使用血糖测量仪检测各组大鼠随机血糖值。

1.4 大鼠足底纤维力度的测定 于开始给予EGCG处理后的第4周和第8周，分别测定各组大鼠的足底纤维力度。将大鼠置于金属网中，其上盖有透明的树脂玻璃罩，令大鼠充分适应该环境30 min。随后使用Von Frey纤维丝按自足跟至足尖的顺序刺激大鼠足底中部，使纤维发生弯曲。在刺激过程中或移开纤维丝瞬间大鼠出现明显的抬足、躲避、舔脚等反应，则记为阳性反应。每一标号的纤维对每侧足底刺激5次(双侧共10次)，每次刺激持续5 s，间隔15 s，如出现5次以上阳性反应，则记录该纤维力度。如果发现大鼠出现5次不抬腿的情况，则换用更高刻度的纤维。

1.5 大鼠足底反应时间的测定 于开始给予EGCG处理后的第4周和第8周，分别测定各组大鼠的足底反应时间。将大鼠置于独立的有机玻璃笼中，令大鼠充分适应该环境30 min。通过应用热辐射测痛仪对大鼠足底中心位置进行热光束刺激(刺激光源强度为55℃)，大鼠因难以耐受热痛出现抬足反应，此时光束会自动切断并自动记录反应时间。对每只大鼠的每侧足底共刺激5次(双侧共10次)，每次间隔10 min，记录10次的反应时间测量值并取其平均值。

1.6 大鼠脊髓p38 MAPK和IL-1β基因表达水平的测定 于给予EGCG处理8周后，使用过量戊巴比妥钠麻醉处死各组大鼠，分离大鼠腰段脊髓L5背角组织。使用RNA提取试剂盒提取大鼠L5背角总RNA，随后以2 μg RNA为上样量，按照试剂盒说明书操作步骤，在20 μL反应体系中对提取的RNA进行反转录反应，生成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参基因。使用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪对所选取的目标基因进行PCR扩增，引物序列如下：p38MAPK上游引物：5′-TCCAAGGGCTACACCAAATC-3′，下游引物：5′-TGTTCCAGGTAAGGGTGAGC-3′；IL-1β上游引物：5′-TGATGTTCCCATTAGACAGC-3′，下游引物：5′-GAGGTGCTGATGTACCAGTT-3′；GAPDH上游引物：5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，下游引物：5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。qPCR的反应体系：cDNA模板1.6 μL，上、下引物(浓度为10 μmol/L)各0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，最后使用去离子水将反应体系补充至20 μL。具体反应条件：95℃变性处理3 min，95℃、60℃各30 s，循环40次后，进行55℃退火处理15 s。每种基因设置4个复孔，使用2-ΔΔCt法对p38MAPK和IL-1β的相对表达水平进行半定量分析。

1.7 统计学分析 使用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用随机区组设计方差分析，使用基于Bonferroni的多重检验分析方法进行两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 5组大鼠不同时间点的足底纤维力度及反应时间比较 在第4、8周，5组大鼠的足底纤维力度及反应时间比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。其中，糖尿病组及各剂量EGCG组在各个时间点的纤维力度及反应时间均低于对照组(均P<0.05)；与糖尿病组比较，50 mg/kg EGCG组和100 mg/kg EGCG组各时间点的纤维力度及反应时间均增高(均P<0.05)，10 mg/kg EGCG组第8周的纤维力度及反应时间均增高(均P>0.05)；50 mg/kg EGCG组和100 mg/kg EGCG组在各个时间点的纤维力度及反应时间均高于10 mg/kg EGCG组(均P<0.05)，但50 mg/kg EGCG组和100 mg/kg EGCG组间差异并无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 5组大鼠不同时间点的足底纤维力度及反应时间比较(x±s)

2.2 不同浓度EGCG对于糖尿病神经病理性疼痛大鼠随机血糖的影响 在第4、8周，5组大鼠的随机血糖比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其中糖尿病组及各剂量EGCG组的随机血糖高于对照组(均P<0.05)。但3个剂量的EGCG组之间随机血糖值差异均无统计学意义(P>0.05)，且与糖尿病组差异也无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 5组大鼠不同时间点的随机血糖水平比较(x±s，mmol/L)

2.3 不同浓度EGCG对糖尿病神经病理性疼痛大鼠脊髓p38MAPK和IL-1β基因表达的影响 于给予EGCG处理第8周，5组大鼠脊髓组织p38MAPK和IL-1β mRNA相对表达水平差异均有统计学意义(均P<0.05)。其中，糖尿病组和10 mg/kg EGCG组的p38MAPK和IL-1β mRNA相对表达水平均高于对照组，50 mg/kg EGCG组的IL-1β mRNA相对表达水平亦高于对照组(均P<0.05)；50 mg/kg EGCG组和100 mg/kg EGCG组的p38MAPK和IL-1β mRNA相对表达水平均低于糖尿病组及10 mg/kg EGCG组(均P<0.05)，而糖尿病组及10 mg/kg EGCG组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 5组大鼠脊髓组织p38MAPK和IL-1β mRNA相对表达水平比较(x±s)

3 讨 论

近年来，绿茶多酚的主要成分EGCG(约占茶多酚总量的80%)的药理学效应逐渐受到学者们的广泛关注。已有研究表明EGCG具有显著的抗菌、抗氧化和抗肿瘤生成效应[11]。此外，EGCG能够对抗血管增生和血管中的血栓形成[12]。同时，EGCG也被证实具有十分显著的抗炎效应，对于细胞炎性因子的表达以及炎症相关疾病的进展具有显著的抑制效果[13]。更重要的是，最近的动物实验表明，EGCG能明显缓解机体疼痛[9-10]。这为EGCG对抗最重要且危害最大的糖尿病并发症—糖尿病神经病理性疼痛，提供了充分的理论依据。与目前临床上常见的缓解糖尿病神经病理性疼痛的治疗药物相比，如抗抑郁类药物、抗惊厥类药物和镇痛类药物，EGCG具有副作用更小和治疗成本更低的优势。

STZ能够迅速破坏负责产生胰岛素的胰岛B细胞，从而导致胰岛素分泌减少和血糖急剧升高。因此本实验通过腹腔注射STZ构建胰岛素依赖性速发型糖尿病大鼠模型。同时，大量的研究显示，通过注射STZ构建的糖尿病大鼠也能够表现出糖尿病神经病理性疼痛的症状，包括机械疼痛阈值和反应时间的显著降低，以及神经传导速率的显著下降[14-15]。而在本研究中，通过STZ腹腔注射建模的大鼠的纤维力度及反应时间均低于对照组大鼠(均P<0.05)，且这种疼痛阈值在建模成功后的8周内一直维持在较低水平，即糖尿病大鼠均具有糖尿病神经病理性疼痛的典型特征，提示成功建立了糖尿病神经病理性疼痛模型。进一步分析不同浓度的EGCG对于糖尿病神经病理性疼痛的作用效果，结果显示，第4周时10 mg/kg EGCG组与糖尿病组的纤维力度及反应时间差异并无统计学意义(均P>0.05)，第8周时10 mg/kg EGCG组的纤维力度及反应时间高于糖尿病组(P<0.05)，这提示在早期10 mg/kg的EGCG对于糖尿病大鼠纤维力度及反应时间的改变效果较为微弱，只在EGCG治疗8周后才开始产生一定的镇痛效应。在第4、8周，50 mg/kg EGCG组和100 mg/kg EGCG组的纤维力度及反应时间均高于对照组及10 mg/kg EGCG组(均P<0.05)，说明50 mg/kg的EGCG和100 mg/kg的EGCG在第4周即可对糖尿病大鼠的纤维力度及反应时间具有较为显著的改善效应，且作用优于10 mg/kg的EGCG。因此，EGCG能显著缓解糖尿病神经病理性疼痛，并具有一定的量效关系。此外，3个剂量的EGCG组与糖尿病组的随机血糖值差异均无统计学意义(P>0.05)，说明EGCG的应用对糖尿病大鼠的血糖没有显著影响。

MAPK信号是细胞中一个十分重要的信号通路，它能够介导细胞的增殖、分化、凋亡、炎症等一系列细胞反应。而大量的研究也表明，MAPK在糖尿病患者和动物的脊髓和背根神经中被广泛激活，且在糖尿病神经病理性疼痛的中枢和外周敏化中发挥至关重要的作用[16-17]。而p38亚型作为MAPK的主要亚型之一，也已被证实在糖尿病神经病理性疼痛中发挥关键作用[18]。本研究结果显示，糖尿病组的p38MAPK mRNA相对表达水平均高于对照组(P<0.05)，进一步证实了p38MAPK在糖尿病动物的脊髓组织中被广泛激活。此外，50 mg/kg EGCG组和100 mg/kg EGCG组的p38MAPK mRNA相对表达水平均低于糖尿病组(均P<0.05)，提示50 mg/kg和100 mg/kg的EGCG能够显著抑制糖尿病大鼠脊髓中p38MAPK的基因表达，但未发现10 mg/kg的EGCG对p38MAPK的表达有显著的抑制效应。以上EGCG的量效结果与其对于纤维力度和反应时间的作用效果类似，进一步表明p38MAPK的表达抑制可能在EGCG缓解糖尿病神经病理性疼痛中发挥重要作用。此外，糖尿病组的 IL-1β mRNA相对表达水平高于对照组(P<0.05)，而IL-1β是最重要且具有代表性的细胞炎性因子，提示糖尿病的脊髓组织处于炎性因子高表达状态。既往研究表明，EGCG能够抑制不同病理状态下组织细胞中的炎性因子IL-1β的表达[8]。在本研究中，50 mg/kg EGCG组和100 mg/kg EGCG组的IL-1β mRNA相对表达水平均低于糖尿病组(均P<0.05)，这进一步证实了EGCG具有较强的抗炎性效应，并提示50 mg/kg和100 mg/kg的EGCG能够显著抑制糖尿病大鼠脊髓组织的炎症反应。

综上所述， EGCG可以缓解糖尿病神经病理性疼痛，并具有一定的量效关系，而其可能通过抑制脊髓组织中p38MAPK的表达以及炎症反应而发挥作用。这或可为EGCG广泛应用于糖尿病神经病理性疼痛的临床治疗提供实验依据。