响应曲面法优化壁虎水溶性蛋白的提取工艺

张荳，宋肖桦，胡慧华

北京中医药大学 中药学院，北京 102488

壁虎又名守宫、天龙、蝎虎等，为壁虎科动物无蹼壁虎GekkoswinhonisGüenther、多疣壁虎G.japonicusDumeril et Bibron或蹼趾壁虎G.subpalmatusGüenther等的全体，寒，咸，有小毒，具有祛风定惊、解毒散结的功效[1]，主治中风瘫痪、手足不举、历节风痛、风痉惊痫、小儿疳痢、疬风瘰疬、血积成痞，疗蝎螯等。目前国内外众多学者致力于研究壁虎抗肿瘤活性物质、药理作用，已有研究表明，壁虎多肽及蛋白质组分可显著抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导细胞凋亡[2-4]。因此优化壁虎蛋白质的提取工艺对于进一步的药理作用研究具有重要意义。壁虎药材尚未载入2015年版《中华人民共和国药典药典》，各地方标准对其质量要求也无明确规定。因此，对蛋白质含量的定量控制也是确保壁虎药材疗效的一个有效手段[5]。

正交试验法优化虽然能通过研究多种因素，减少实验次数，最终找出最佳因素水平组合，但却不能从整个区域中计算出单因素和指标间确定的函数表达式即回归方程，并且不能探讨单因素之间的交互作用[6]，因此，建立的数学模型预见性、重复性差。Box-Behnken响应曲面法因其可以准确表达单因素与指标之间的关系，已被广泛用于各行业工艺的优化[7]。本实验拟通过单因素试验与响应面分析法设计筛选壁虎蛋白质的提取工艺，以期为中药壁虎水溶性蛋白质的提取工艺研究、质量标准制订以及抑制肿瘤研究方面提供参考。

1 材料

1.1 仪器

UV-P7型紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；101-2AB型烘箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；SB25-12DTD型超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；HC-3518型离心机(安徽省中科中佳科学仪器有限公司)；HC-300T固体粉碎机(永康市天祺盛世工贸有限公司)；FA1104B型万分之一电子天平(上海越平科学仪器有限公司)。

1.2 试药

牛血清白蛋白(BSA，北京索莱宝科技有限公司，批号：920T053)；所用试剂均为分析纯；水为去离子水。

生品壁虎产自安徽，经北京中医药大学胡慧华副教授鉴定为壁虎科动物无蹼壁虎GekkoswinhonisGuenther的干燥全体。

2 方法与结果

2.1 供试品的制备

2.1.1对照品溶液的配制 精密称取 BSA标准品10 mg，用去离子水溶解并定容至100 mL，即得0.1 g·L-1的BSA标准溶液，备用。

2.1.2考马斯亮蓝染液的配制 精密称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50 mL 90%的乙醇中，再加入85%的磷酸100 mL，后用去离子水定容至1000 mL，置烧杯中，超声4 h，定量滤纸过滤[8]，即可置4 ℃冰箱中备用。

2.1.3标准曲线的制备 精密量取BSA标准溶液0、0.1、0.3、0.6、0.8、1 mL，分别置于10 mL具塞刻度试管中，补加去离子水至 1 mL，制成不同浓度的BSA溶液。然后分别加入5 mL考马斯亮蓝染色溶液，染色5 min，摇匀。以第1份不含对照品溶液作为空白对照，595 nm为检测波长，检测对照品溶液的吸光度，以蛋白质含量(X)为横坐标，以吸光度(Y)为纵坐标，进行线性回归分析。线性回归方程为Y=9.853 7X+0.097 4，r=0.999 9，结果表明，0～100 μg线性关系良好。

2.1.4样品的配制

2.1.4.1药材预处理 将药材粉末(过四号筛)置于干燥器内干燥12 h后，包于滤纸包内，用石油醚索氏提取10 h[9]。待药渣挥干石油醚后收集，以备提取可溶性蛋白。

2.1.4.2供试品溶液的配制 精密称取预处理后的药材粉末0.72 g(相当于索氏提取脱脂前1 g)，在考察提取因素条件下(超声时间、超声温度、pH、料液比)超声提取，5000 r·min-1离心(离心半径8.8 cm)15 min，取上清液作为待测溶液，每个处理重复3次。分别吸取一定量的待测溶液，测定吸光度，按2.1.3项下BSA回归方程计算中药壁虎中水溶性蛋白的含量。

2.2 单因素试验

2.2.1超声提取时间对壁虎水溶性蛋白含量的影响

精密称取预处理后的药渣粉末0.72 g(相当于脱脂前的药材粉末质量1 g)于100 mL锥形瓶中，以去离子水(pH为6.8)20 mL为提取溶剂，固定超声提取温度为50 ℃，料液比为1∶20，分别考察超声时间10、20、40、60、80、100 min时壁虎中水溶性蛋白的含量(n=3)，见图1。

图1 不同提取时间对蛋白质含量的影响

从图1可以看出，壁虎可溶性蛋白的含量随提取时间的延长呈现先上升后下降趋势，当超声时间为10～80 min时含量呈现上升趋势；当超声时间为80～100 min时含量呈现下降趋势。综上所述，可以确定提取时间为80 min时提取率最高。因此本研究在响应曲面提取时间因素的3个水平选择提取率较高的60、80、100 min。

2.2.2不同料液比对壁虎水溶性蛋白含量的影响 精密称取壁虎预处理后的药渣粉末0.72 g(相当于脱脂前的药材粉末质量1 g)，以去离子水(pH为6.8)为提取溶剂，固定超声提取温度为50 ℃，超声时间为20 min，分别考察料液比1∶5、1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶100时壁虎中水溶性蛋白的含量(n=3)，见图2。

图2 不同料液比对蛋白质含量的影响

从图2可以看出，随着料液比的增加，壁虎药材可溶性蛋白的含量呈现先上升后下降的趋势，当料液比在1∶5～1∶50时蛋白质含量呈现上升趋势；当料液比在1∶50～1∶100时蛋白质含量呈现下降趋势。综上所述，可以确定料液比为1∶50时提取率最高。因此本研究在响应曲面料液比因素的3水平选择提取率较高的1∶30、1∶50、1∶70。

2.2.3不同pH对壁虎水溶性蛋白含量的影响 精密称定壁虎预处理后的药渣粉末0.72 g(相当于脱脂前的药材粉末质量1 g)，固定超声提取温度为50 ℃，超声时间为20 min，料液比为1∶20，分别考察加入去离子水(调pH分别为3、5、7、9、11、13)20 mL时壁虎中水溶性蛋白的含量(n=3)，见图3。

图3 不同pH对蛋白质含量的影响

从图3可以看出，碱性条件下，壁虎药材可溶性蛋白提取率显著高于酸性和中性条件下，并且随着pH的升高，提取的蛋白质含量显著增加，这可能因为壁虎含有较多的碱性氨基酸，随着pH的升高，大量氨基酸在等电点附近沉淀析出。综上所述，可以确定pH 14时蛋白质含量最高，因此本研究在响应曲面pH因素的三因素选择12、13、14。

2.2.4不同温度对壁虎水溶性蛋白含量的影响 精密称定壁虎预处理后的药渣粉末0.72 g(相当于脱脂前的药材粉末1 g)。以去离子水(pH为6.8)20 mL为提取溶剂，固定提取时间为20 min，料液比为1∶20，分别考察20、30、40、50、60、70、80 ℃时壁虎中水溶性蛋白的提取率(n=3)，见图4。

图4 不同温度对蛋白质含量的影响

从图4可以看出，随着温度的增加，壁虎可溶性蛋白提取率呈现先上升又下降又上升的趋势，但整体变化趋势不明显，同时考虑到超声提取时，温度不易控制，因此不将温度纳入壁虎蛋白提取工艺的考察范围之内。

2.3 Box-Behnken响应面试验设计

2.3.1响应模型建立与分析 在单因素考察的基础上，确定提取时间、料液比、pH 3个因素，运用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken模型设计试验组，将壁虎水溶性蛋白含量作为指标，进行响应曲面分析。因素水平表见表1，试验设计与结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 壁虎中水溶性蛋白提取工艺响应面试验因素水平

表2 壁虎中水溶性蛋白提取工艺响应面实验设计与结果

表3 壁虎中水溶性蛋白提取工艺响应面方差分析

对所记录的数据进行回归分析，得出料液比(A)、pH(B)和提取时间(C)3个因素对壁虎水溶性蛋白含量影响的二次多项回归方程：Y=189.27+54.78A+60.29B+4.59C+27.84AB+4.37AC-6.32BC-1.41A2-60.08 B2-10.24C2。从表3方差分析可知，该模型差异有统计学意义(P<0.001)，决定系数R2=0.980 5，表明所得值与预测值拟合程度良好。失拟项P为0.053 5(>0.05)，说明失拟项差异无统计学意义，表明未知因素干扰小。

结果表明该回归方程模型拟合度良好，实验误差小，能够精准反映A、B、C 3个因素对壁虎水溶出蛋白质含量的影响，因此壁虎水溶性蛋白提取工艺的优化可以采用此模型。回归方程的显著性表明：一次项回归方程中，A、B差异有统计学意义，对蛋白质含量的影响较大，而C差异无统计学意义；在交互项中，AB交互项差异有统计学意义，而其他2个交互项差异无统计学意义。在二次项中，B2差异有统计学意义，其他2项差异无统计学意义。综上所述，3个因素水平对蛋白质含量的影响依次为：B>A>C。

2.3.2响应曲面图直观分析 图5～7为3个因素之间的三维曲面图和二维平面等高线图，从图中可直观得出因素之间的交互作用以及交互对蛋白质含量的影响。

图5 料液比和pH对蛋白质提取影响的等高线图和响应曲面图

图6 料液比和提取时间对蛋白质提取影响的等高线图和响应曲面图

图7 pH和提取时间对蛋白质提取影响的等高线图和响应曲面图

图5、7中响应面图pH坡度较陡，均表明pH对壁虎蛋白质提取的影响较大，图6中，料液比和提取时间的响应面坡度较平缓，表明两者对壁虎蛋白质提取的影响不大。同时表明以上响应面图分析结果与方差分析结果相符。

2.3.3验证实验 根据单因素实验和二次回归模型总和分析，在Design-Expert 8.0.6软件中，选择目标为水溶性蛋白含量最大值，预测得到最优提取工艺参数：料液比为1∶70，提取时间为84.33 min，pH为13.72。在此条件下，蛋白质质量分数的预测值为275.431 mg·g-1。为了验证实验结果的可靠性，要对模型的提取工艺进行验证。结合实验的可操作性，将蛋白质的提取工艺参数调整为：料液比为1∶70，提取时间为84 min，pH为14。

应用此工艺条件进行3次平行验证实验。结果壁虎药材中总水溶性蛋白平均质量分数为272.92 mg·g-1，与预测值275.431 mg·g-1相比，RSD为0.54%，表明该响应曲面方法得到的回归模型与实际情况拟合很好，该模型可以很好预测壁虎蛋白质提取含量。

3 讨论

我国是原发性肝癌发病率和病死率均较高的国家，壁虎多肽活性组分能够抑制肝癌细胞的生长和增殖[10-12]，壁虎在民间更是被称为“抗肿瘤之星”。但壁虎经常被当做蛤蚧的混淆品入药。随着壁虎被现代药理研究和临床应用，其优点被更多人所发现，今已广泛治疗临床多种疾病[5]。壁虎药材的传统炮制方法是用竹片贯穿头腹，将尾用绳固定于竹片上撑开，然后用微火烤干或阴干。在炮制过程中可能会导致蛋白质和酶等活性物质的破坏。现有研究表明，壁虎多肽及蛋白质组分是其抗肿瘤作用的重要活性成分。因此，蛋白质含量的定量测定可作为壁虎药材质量评价的一个重要指标。

响应曲面法具有精度高，预测性好的优点[13]，能够快速得出工艺中多因素影响的最佳条件。本试验首先进行了单因素试验，然后采用Box-Behnken响应曲面法试验进行壁虎水溶性蛋白的超声提取工艺优化，建立的二次多项回归模型显著性良好，能够准确地反映3个因素对壁虎水溶性蛋白含量的影响。壁虎水溶性蛋白超声提取最佳条件：料液比为1∶70，提取时间为84 min，pH为14，蛋白质质量分数为275.431 mg·g-1，通过验证实验可知，所采用的响应面法优化理论与试验值相近，结果可靠。