创伤病人血清游离线粒体含量变化及其临床意义

郭恩伟， 任大力， 章冰玉， 杨 峰， 姚峪岚， 贾 凌， 余 琳， 冯 刚

(海军军医大学附属公利医院重症医学科，上海 200135)

炎症反应是创伤的临床特征，其发病机制至今尚未完全阐明。生理情况下线粒体DNA（mitochondria DNA，mtDNA）包含在细胞内线粒体的内膜内，不与免疫细胞接触。由于mtDNA具有与细菌DNA的相似性和先天性免疫应答功能，创伤时mtDNA释放到血循环中，激活免疫细胞，引起炎症反应。因此，目前认为创伤后炎症反应与mtDNA有关。循环中游离的 mtDNA （cell-free mtDNA，cfmtDNA）是mtDNA碎片。尽管先前一些研究报道创伤病人血液cf-mtDNA含量升高，但其时间动态变化规律及影响因素尚无一致结论。本研究动态观察不同类型创伤病人血清cf-mtDNA含量及炎症相关指标变化，分析其时间动态变化规律及影响因素，以及与炎症反应相关指标的相关性，探讨血清cf-mtDNA含量变化的临床意义。

资料与方法

一、一般资料

选取2014年1月至2017年2月在我院就诊的年龄≥18岁的创伤病人37例为创伤组，男25例，女 12 例，中位年龄 51（39，63.5）岁（见统计学方法）。中位损伤严重度评分 （injury severity score，ISS）为 25（18，31.5）分。 创伤原因：车祸伤 18 例，摔伤12例，坠落伤7例。多发伤20例，中位ISS为28（26，36）分,中位年龄 48（32.8，64.8）岁；单发伤 17 例（脑外伤14例，创伤性脾破裂2例，左下肢多发性骨折 1 例），中位 ISS 为 18（16，25）分，中位年龄 53（44，63.5）岁。创伤组37例中，创伤性休克15例，创伤后并发器官功能损伤13例，死亡5例。对照组10 例，男 6 例，女 4 例，中位年龄 41（28～52）岁。 本研究经医院伦理委员会批准，病人签署知情同意书。

二、方法

（一）监测指标

在病人创伤后4 h、24 h、72 h和7 d，分别抽取静脉血5 mL至血清分离管，室温下垂直静置2 h，于 2℃～8℃、10 360 r/min离心15 min后取上清液，标本置于-80℃保存待测。分别检测上述时间点的血清cf-mtDNA、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、 肿瘤坏死因子 α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）含量，同时计算全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）评分，记录 28 d 内并发器官功能损伤和死亡例数。

（二）血清cf-mtDNA含量检测

所有标本均统一集中检测，采用同一批号微量基因组DNA提取试剂盒提取血清DNA，以减少批次间误差。

实时定量聚合酶链反应检测mtDNA中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶1（nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase 1，ND1）含量。 首先合成两对引物，一对 （ND1-F，ND1-R）扩增mtDNA中ND1 基因，另一对（HGB-1，HGB-2）扩增内参基因（human globulin）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列为:ND1-F5′CCCTAAAACCCGCCACATCT-3′,ND1-R5′-GAGCGATGGTGAGAGCTAAGGT-3′；HGB-15′-GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA-3′；HGB-2 5′-CCTTGATACCAACCTGCCCAG-3′。

应用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System的操作方法的反应体系和反应条件，以双蒸水为空白对照，反应体系为20 μL。两步法 PCR扩增标准程序。①预变性：95℃30 s，重复1次。②PCR反应：95℃5 s，60℃34 s，重复40次。③熔解曲线。反应结束后建立实时聚合酶链反应的扩增曲线和融解曲线，计算 2-ΔΔct值。

（三）血清 TNF-α、IL-6、CRP 含量的检测

采用人亲和素-生物素复合ELISA试剂盒 （武汉华美生物工程有限公司），使用酶标仪（Multiskan MK3，美国Thermo公司）进行检测，在450 nm处测得吸光度（A）值，样本质量浓度与A值成正比，通过绘制标准曲线得出标本相应检测数值。血清CRP含量采用免疫散射速率法（全程CRP检测试剂盒，石家庄禾柏生物），使用生物特定蛋白分析仪（HP-083/4-I，禾柏生物技术股份有限公司）检测。

（四）ISS

根据解剖划分为6个区域，计算3个最严重的损伤区域简明创伤分级 （abbreviated injury scale,AIS）分值的平方和。

（五）SIRS评分

根据SIRS评分标准计算，以下每个参数代表1分，体温＞38℃或＜36℃，心率＞90次/min，呼吸频率＞20次/min或动脉血二氧化碳分压＜32 mmHg，白细胞计数＞12×109/L或＜4×109/L或出现10%杆状核细胞。炎症反应诊断标准：SIRS评分≥2分且CRP＞10 mg/L。

（六）血清cf-mtDNA及炎症反应相关指标比较

分别比较创伤组与对照组病人、多发伤组与单发伤组病人、无休克创伤组与创伤性休克组病人、创伤无并发器官功能损伤组与创伤并发器官功能损伤组病人创伤后4 h、24 h、72 h和7 d血清cf-mtDNA 相对含量，血清 CRP、TNF-α、IL-6 含量及SIRS评分。分别分析血清cf-mtDNA相对含量与ISS，血清 CRP、TNF-α、IL-6 含量，SIRS 评分的相关性。

三、统计学方法

应用SPSS 22.0统计学软件进行分析。血清CRP、TNF-α、IL-6含量及 SIRS评分等呈正态分布的计量资料以均数±标准差表示。组间比较采用独立样本t检验或重复测量设计资料方差分析。年龄、ISS、血清cf-mtDNA相对含量等非正态分布的计量资料以中位数 M（QL,QU）表示[QL（lower quartile）表示下四分位数 （即 25%位数），QU（upper quartile）表示上四分位数（即75%位数）]。组间比较采用非参数独立样本检验。相关性分析采用Spearman相关分析，应用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线选取最佳临界值，评估创伤后血清cf-mtDNA含量诊断炎症反应的价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

创伤病人伤后24 h、72 h血清cf-mtDNA含量明显高于对照组 （P＜0.05），但伤后4 h、7 d血清cf-mtDNA含量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。创伤病人伤后24 h血清cf-mtDNA含量明显高于 4 h 含量（P＜0.05）（见表 1）。

与单发伤组比较，多发伤组病人伤后4 h、24 h、72 h、7 d血清cf-mtDNA相对含量均明显升高（P值分别为＜0.05、＜0.01、＜0.01、＜0.05）。 60 岁以下各年龄亚组多发伤病人伤后24 h、72 h血清cf-mtDNA相对含量明显高于单发伤组（均P＜0.05）。但60岁以上亚组多发伤病人伤后各时间点血清cf-mtDNA相对含量与单发伤组比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）（见表 2）。

表1 创伤病人不同时间血清cf-mtDNA含量M(QL,QU)与对照组比较

表2 多发伤组与单发伤组病人不同时间血清cf-mtDNA含量M(QL,QU)比较

与无休克创伤组比较，创伤性休克组病人伤后24 h血清cf-mtDNA相对含量明显升高 （P＜0.01）。创伤性休克组病人和无休克创伤组病人伤后24 h血清cf-mtDNA相对含量均明显高于4 h水平（P分别为＜0.01、＜0.05）（见表 3）。

与创伤无并发器官功能损伤组比较，创伤并发器官功能损伤组病人伤后4 h、24 h血清cf-mtDNA相对含量明显升高（均 P＜0.05）（见表 4）。

与对照组比较，多发伤组病人伤后4 h、24 h、72 h、7 d 血清 TNF-α 含量升高（P 值分别为＜0.01、＜0.01、＜0.01、＜0.05），24 h 达到高峰；单发伤组病人伤后24 h血清TNF-α含量升高（P＞0.05）。与单发伤组比较，多发伤组病人伤后24 h、72 h血清TNF-α含量升高（均 P＜0.01）（见表 5）。

与对照组比较,单发伤组病人伤后4 h、24 h血清IL-6含量升高（P＜0.05）；多发伤组病人伤后4 h、24 h 血清 IL-6 含量升高（P＜0.05，P＜0.01）,且 24 h达到高峰。与单发伤组比较，多发伤组病人伤后24 h血清 IL-6 含量升高（P＜0.01）（见表 6）。

与对照组比较,无论是单发伤组还是多发伤组病人伤后24 h、72 h、7 d血清CRP含量均明显升高（均 P＜0.01），且 24 h开始升高，72 h达到高峰，持续7 d。与单发伤组比较，多发伤组病人伤后72 h血清 CRP 含量明显升高（P＜0.05）（见表 7）。

与对照组比较,无论是单发伤组还是多发伤组病人伤后 4 h、24 h、72 h、7 d SIRS 评分均显著升高（均P＜0.01）。与单发伤组比较，多发伤组病人伤后4 h、24 h SIRS 评分明显升高（P＜0.05）（见表 8）。

表3 无休克创伤组与创伤性休克组病人伤后4 h～7 d血清cf-mtDNA含量M(QL,QU)比较

表4 创伤无并发器官功能损伤组与创伤并发器官功能损伤组病人伤后4 h～7 d血清cf-mtDNA含量M(QL,QU)比较

表5 多发伤与单发伤病人伤后4 h至7 d血清TNF-α含量(±s)（ng/L）比较

表5 多发伤与单发伤病人伤后4 h至7 d血清TNF-α含量(±s)（ng/L）比较

※:与对照组比较，P＜0.05；※※:与对照组比较，P＜0.01；△△:与 4 h 比较，P＜0.01；★★:与单发伤组比较，P＜0.01

组别 例数 ISS(分)M(QL,QU) 4 h 24 h 72 h 7 d单发伤组 17 18(16,25) 7.41±4.31 10.67±6.41※ 7.26±4.11 9.37±7.34多发伤组 20 28(26,36) 10.83± 5.45※※ 17.22±9.27△△★★※※ 13.74±5.00★★※※ 12.37±7.73※对照组 10 0(0,0) 4.67±0.47 4.67±0.47 4.67±0.47 4.67±0.47

表6 多发伤与单发伤病人伤后4 h～7 d血清IL-6含量(±s )（ng/L)比较

表6 多发伤与单发伤病人伤后4 h～7 d血清IL-6含量(±s )（ng/L)比较

※:与对照组比较，P＜0.05；※※:与对照组比较，P＜0.01；△:与 4 h 比较，P＜0.05；★★:与单发伤组比较，P＜0.01

组别 例数 ISS(分)M(QL,QU) 4 h 24 h 72 h 7 d单发伤组 17 18(16,25) 72.74±46.96※ 86.38±51.21※ 55.23±74.58 39.43±40.16多发伤组 20 28(26,36) 95.07±82.3※ 162.64±165.19△★★※※ 59.97±71.55 53.59±62.28对照组 10 0(0,0) 6.62±2.31 6.62±2.31 6.62±2.31 6.62±2.31

表7 多发伤与单发伤病人伤后4 h～7 d血清CRP含量(±s)（mg/L）比较

表7 多发伤与单发伤病人伤后4 h～7 d血清CRP含量(±s)（mg/L）比较

※※:与对照组比较，P＜0.01；△△:与 4 h 比较，P＜0.01；★:与单发伤组比较，P＜0.05

组别 例数 ISS(分)M(QL,QU) 4 h 24 h 72 h 7 d单发伤组 17 18(16,25) 11.79± 10.12 105.18±64.76△△※※ 112.51±67.34△△※※ 95.42±72.28△△※※多发伤组 20 28(26,36) 16.04± 14.77 117.01±57.27△△※※ 156.88±43.83△△★※※ 103.01±65.06△△※※对照组 10 0(0,0) 4.46±2.75 4.46±2.75 4.46±2.75 4.46±2.75

表8 多发伤与单发伤病人伤后4 h～7 d SIRS评分(±s)（分)比较

表8 多发伤与单发伤病人伤后4 h～7 d SIRS评分(±s)（分)比较

※※:与对照组比较，P＜0.01；★:与单发伤组比较，P＜0.05

组别 例数 ISS(分)M(QL,QU) 4 h 24 h 72 h 7 d单发伤组 17 18(16,25) 1.47±1.01※※ 1.82±1.19※※ 1.53±0.80※※ 1.53±1.23※※多发伤组 20 28(26,36) 2.10±0.85★※※ 2.55±0.76★※※ 2.05±0.71※※ 1.85±0.93※※对照组 10 0(0,0) 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00

创伤28 d内死亡病人血清cf-mtDNA相对含量峰值虽高于生存组，但差异无统计学意义（P＞0.05）（见表 9）

表9 死亡组与生存组血清cf-mtDNA相对含量峰值M(QL,QU)比较

创伤后24 h血清cf-mtDNA相对含量与ISS成正相关（r=0.454，P=0.004）。 创伤后 4 h～7 d 血清cf-mtDNA相对含量与 SIRS评分成正相关 （r=0.458，P=0.000 1）。 创伤后 4 h～7 d 血清 cf-mtDNA相对含量与血清IL-6含量成正相关 （r=0.252，P=0.005）。创伤后4 h～24 h血清cf-mtDNA相对含量与血清CRP含量成正相关 （r=0.264，P=0.028）。创伤后 4 h～7 d血清cf-mtDNA相对含量与血清TNF-α 不相关（r=-0.058，P=0.511）。

创伤后4 h～7 d血清cf-mtDNA相对含量诊断炎症反应ROC曲线下面积为0.752（P=0.000 01），95%CI：0.668～0.836（见图 1）。根据最大约登指数计算结果，最佳临界值为0.075 3，其诊断炎症反应的灵敏度63.6%，特异度85.5%。

图1 创伤后4 h～7 d血清cf-mtDNA相对含量诊断炎症反应ROC曲线

讨 论

创伤是一个严重的损伤,是青壮年的主要死因。其中20%死于器官功能衰竭或感染并发症。失控的炎症反应是其病理生理基础[1]。目前认为mtDNA与创伤后炎症反应直接相关[2]。生理情况下mtDNA包含在细胞内线粒体的内膜内，不与免疫细胞接触。但在创伤情况下，由于机械性、缺血再灌注、炎症等损伤导致细胞被破坏，释放mtDNA。研究发现在损伤20 min后可检测到血浆mtDNA[3]。创伤病人入院时血液cf-mtDNA含量升高[4]，但其时间动态变化规律尚未明了。两项研究动态观察了创伤后不同时间点血液中cf-mtDNA含量的变化[5-6]，但结果不一致。为探索创伤后血液中cf-mtDNA含量的变化规律，本研究动态观察创伤后1周内不同时间点血清cf-mtDNA相对含量的变化。结果发现创伤后4 h血清cf-mtDNA含量开始升高，24 h～72 h血清cf-mtDNA含量显著升高，其峰值浓度在伤后24 h，7 d后恢复。与Mcllroy等[5]报道结果一致，进一步在临床上证实创伤可导致血液中cf-mtDNA升高，阐明创伤后血液中cf-mtDNA含量变化规律，为早期目标干预提供参考。

进一步分析发现，创伤性休克病人伤后24 h血清cf-mtDNA相对含量明显高于无休克的创伤病人，说明创伤后cf-mtDNA释放与缺血再灌注损伤有关。休克是影响创伤释放cf-mtDNA的重要因素。其机制可能为创伤性休克引起组织缺血、缺氧和细胞能量消耗，从而导致细胞坏死。再灌注会引起过量的活性氧产生,从而加重器官损伤和细胞凋亡，引起 cf-mtDNA释放[7]。

近年来，多项研究发现创伤病人血液cf-mtDNA含量与创伤程度相关[3,6,8-10]。本研究也发现，多发伤病人伤后 4 h、24 h、72 h、7 d 血清 cf-mtDNA 相对含量均明显高于单发伤病人，创伤后24 h血清cf-mtDNA相对含量与ISS成正相关，与有关研究报道结果一致[3]。这些结果提示血清cf-mtDNA含量越高，代表创伤越重，创伤严重程度也是影响创伤释放cf-mtDNA的重要因素。因此，血清cf-mtDNA含量可作为创伤严重程度的间接指标。

mtDNA与细菌DNA结构相似，具有先天性免疫应答功能。体外实验和动物模型已证实mtDNA可引起炎症反应[11-12]。临床研究发现，炎症反应病人血液中cf-mtDNA含量高于无炎症反应病人。目前研究认为，mtDNA可与中性粒细胞膜上的TLR-9受体结合直接激活中性粒细胞及P38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和NF-κB信号途径[13-15]，促进促炎细胞因子的表达。但不同的疾病病人血液中cf-mtDNA含量与各促炎细胞因子关系结果并不一致。脓毒症休克病人升高的mtDNA与促炎细胞因子无相关性[16]，而急性心肌梗死病人升高的mtDNA与细胞因子TNF-α、IL-6、CRP含量呈正相关[17]。本研究发现，创伤后24 h、72 h随着血清cf-mtDNA升高的同时，血清TNF-α、CRP含量显著升高，创伤后24 h血清IL-6含量也显著升高（P 值分别为＜0.01、＜0.01、＜0.05）。 进一步分析发现，创伤后4 h～7 d血清cf-mtDNA相对含量与 SIRS评分及血清IL-6含量成正相关，创伤后4 h～24 h血清cf-mtDNA相对含量与血清CRP含量成正相关，说明血液中cf-mtDNA含量升高与创伤后炎症反应有关，从临床上进一步提示mtDNA参与创伤后炎症反应。且ROC曲线分析提示，以创伤后4 h～7 d血清cf-mtDNA相对含量0.075 3为临界值，其诊断炎症反应的灵敏度为63.6%，特异度为85.5%，具有一定诊断价值。因此，血液中cfmtDNA含量可作为创伤后炎症反应的间接指标。

高血清mtDNA含量引起的炎症反应可造成不良后果，最近发现mtDNA与损伤后多脏器功能衰竭的发展有关[18-19]。Faust等[20]报道，创伤后48 h血浆mtDNA含量与急性呼吸窘迫综合征显著相关，本研究发现创伤并发器官功能损伤的病人伤后4 h、24 h血清cf-mtDNA含量明显高于创伤无并发器官功能损伤的病人，提示高血清cf-mtDNA含量与继发性器官功能损伤有关。因此，减少cf-mtDNA释放、分解释放的mtDNA和阻断mtDNA受体结合是未来的靶向治疗方向[4,19-21]。

先前多项研究报道死亡病人血液中cf-mtDNA含量显著高于生存者，提出血液中cf-mtDNA含量可预示危重病人的后果。然而，本研究发现，创伤28 d内死亡病人血清cf-mtDNA相对含量峰值虽高于生存病人，但差异无统计学意义。可能原因是样本量较小。另外创伤时，影响mtDNA释放和死亡因素较多，除创伤程度、缺血再灌注和基础疾病等因素外，主要与创伤的部位有关。不同组织细胞线粒体含量不同，骨骼肌、平滑肌、肝细胞和肾小管细胞含量较高，其中骨骼肌线粒体含量最高[4]，而脑组织线粒体含量较少。因此，肌肉组织损伤释放mtDNA较多，但其预后较好，而重度脑损伤释放mtDNA并不多，但病死率较高。本研究死亡病人多为重度脑外伤。因此，应用血液中cf-mtDNA含量预测创伤的预后应结合损伤的部位，还需进一步研究。

创伤早期血清cf-mtDNA含量升高，高血清cfmtDNA含量代表创伤程度重，预示严重炎性反应和不良后果。创伤早期血清cf-mtDNA含量对炎症反应的诊断具有一定价值。