柳蒿化学成分的含量测定及肝损伤保护作用的研究

杨佳明，孟宪兰，王丹萍，秦汝兰*

（1.通化师范学院医药学院，通化134002；2.通化盛吉信生物科技股份有限公司，通化134002；3.通化市园艺研究所，通化134002）

柳蒿Artemisia integrifolia Linn.为菊科蒿属多年生草本植物，又名萎蒿、白蒿、柳叶蒿、水蒿等[1]。广泛分布于我国东北等地，柳蒿芽质嫩，气味独特，幼嫩的地上部分可炒食或作汤菜，从北方达翰尔族人民开始，将其作为野菜广泛食用。柳蒿中含有丰富的氨基酸、维生素和多糖，营养价值十分丰富[2～4]。化学成分研究表明，柳蒿芽中含有丰富的黄酮类成分，具有抗自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等作用[5～7]。

肝脏是机体内以代谢功能为主的重要器官，具有解毒、调节糖、脂代谢平衡的作用[8]。近年来，随着人们生活水平的提高以及生活环境的变化，病毒性肝炎、异源性肝损伤、肝纤维化及自身免疫性肝炎等肝脏疾病成为人类最常见的疾病之一，严重威胁着人类健康[9]。化学性肝损伤是由化学性肝毒性物质所造成的肝损伤，这些化学物质和药物包括酒精、四氯化碳、半乳糖胺、扑热息痛、抗结核药物等均能造成肝细胞损伤[10]。四氯化碳作为经典的肝损伤模型，可靠性强、重复性好，能够准确反映肝细胞的功能、代谢及形态学变化，目前常作为建立肝损伤的模型试剂[11]。民间常用柳蒿全草治疗感冒发烧、肝炎或肝硬化腹水等症状，具有很好的疗效。国内很多学者通过DPPH自由基清除实验，OH-及O2-清除实验，同时结合体内实验测定小鼠或大鼠血清、肝脏中SOD、GSH-Px及MDA等含量，揭示了柳蒿芽具有明显的抗氧化作用[12～13]。

目前，柳蒿药材的研究多集中于化学成分的报道，尚未见其质量控制及保肝作用的研究。因此，笔者采用高效液相色谱法建立同时测定柳蒿中绿原酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素四种含量的方法，并采用四氯化碳诱导的小鼠肝损伤模型，探讨柳蒿对小鼠肝组织的保护作用，为柳蒿芽资源的进一步开发利用提供理论基础。

1 仪器与试药

柳蒿药材采于通化师范学院周边，经通化师范学院医药学院于俊林教授鉴定为柳蒿 （Artemisia integrifolia Linn.）。

昆明种小鼠，清洁级，雄性，体重18～22 g，购于长春小鼠养殖基地。

安捷伦1260高效液相色谱仪 （美国安捷伦有限公司）；BS124S精密电子天平 （泰斯特仪器有限公司）；DNM-9602酶标仪（美国 BioRad公司）；LR-16A低温高速离心机（北京雷勃尔公司）。

绿原酸对照品（批号：110753-200413）、芦丁对照品 （批号：1097-060918）、槲皮素对照品 （批号：100081-20097）均购于中国药品生物制品检定所，木犀草苷对照品（批号：MUST-13050601，）购于成都曼斯特生物科技有限公司；总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒、总抗氧化能力 （T-AOC）测试盒、丙二醛（MDA）测试盒、蛋白定量测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测试盒、谷草转氨酶（AST）测试盒、谷丙转氨酶（ALT）测试盒均购自南京建成生物工程研究所；联苯双酯滴丸（浙江万邦药业有限公司）。乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯，乙醇为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：0.2%-磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5 min，15% →20%B；5 ～35 min，20% →30%B；35 ～50 min，30%→48%B；50～60 min，48%→70%B）； 流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的配制

混合对照品溶液的制备：取绿原酸，芦丁，木犀草苷，槲皮素对照品各适量，精密称定，置于同一10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，制成上述各待测成分质量浓度分别为 1.624 3、0.411 3、0.130 5、0.043 6 mg·mL-1的混合对照品贮备液。

供试品溶液的制备：取柳蒿样品粉末约1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 80%乙醇溶液，称定其重量，超声处理30 min，放置冷却，用80%乙醇补足失去的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 柳蒿提取液的制备

柳蒿干燥粉末30g置于烧杯中，按照“2.2”项下方法制备样品溶液，浓缩备用。

2.4 动物分组及处理

小鼠适应性喂养3d后，随机分为6组，每组10只，即空白组、模型组、阳性药组（联苯双酯滴丸）、柳蒿提取液高剂量组、柳蒿提取液中剂量组、柳蒿提取液低剂量组。空白组与模型组灌胃等体积生理盐水，连续灌胃14 d，末次给药后1 h，除空白组外，其余各组腹腔注射0.1%的CCl4橄榄油溶液0.2 mL/10 g，禁食，不禁水[14]。

2.5 生化指标检测

造模16 h后，戊巴比妥钠麻醉后，采用眼球采血法取血，离心，上清液备用。采血后放血处死，取肝脏组织，制成10%的肝组织匀浆液，离心，上清液备用。按照试剂盒说明书方法分别测定血清中AST、ALT活力，肝组织中MDA含量及GSH-Px、T-AOC、T-SOD水平。

2.6 数据处理

3 结果与分析

3.1 标准曲线的绘制

精密量取 “2.2”项下混合对照品贮备液0.125，0.25，0.5，1，2 mL，分别置于 2 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样分析，以峰面积为纵坐标，质量为横坐标，进行线性回归，线性相关系数在0.999 8～0.999 9，线性关系良好，标准品的液相色谱图见图1，各标准品的回归方程及相关系数见表1。

表1 回归方程与线性范围

图1 混合对照品液相色谱图

3.2 精密度实验

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液，连续进样测定6次，计算峰面积的相对标准偏差表示仪器的精密度。结果，绿原酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素峰面积的RSD 分别为 1.89%，0.81%，0.93%，1.06%（n=6），表明仪器精密度良好。

3.3 稳定性实验

取 “2.2”项下供试品溶液，分别于室温下放置0，2，4，8，12，24 小时后进行分析，计算峰面积的相对标准偏差表示样品的稳定性。结果，绿原酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素峰面积的RSD分别为1.26%，1.33%，0.88%，1.47%，表明供试品溶液在室温下放置24h内稳定性良好。

3.4 重复性实验

取样品适量，按“2.2”项下方法制成6份供试品溶液进样分析，计算峰面积的相对标准偏差表示方法的重复性。结果，绿原酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素峰面积的RSD分别为1.51%，1.06%，1.59%，1.04%，表明本方法重复性良好。

3.5 加样回收率实验

精密称取已知含量的柳蒿药材粉末1 g，5份，加入一定量的绿原酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素对照品混合液，制成供试品溶液进样分析。回收率实验结果见表2，表明实验方法的准确度良好。

表2 加样回收率实验（n=5）

3.6 样品含量测定

取三批样品各适量，制备供试品溶液，进行分析，记录各对照品峰面积并计算含量，结果见表3，液相色谱图见图2。

表3 样品含量测定结果

图2 柳蒿样品液相色谱图

3.7 柳蒿提取液对四氯化碳致肝损伤小鼠血清AST、ALT影响

由表4可以看出，与空白组相比，模型组小鼠血清 AST、ALT 水平显著升高（P＜0.01），表明小鼠急性肝损伤模型制备成功。与模型组比较，柳蒿提取液高、中剂量组小鼠血清AST活性明显降低 （P＜0.05；P＜0.01），且存在浓度依赖性。柳蒿提取液高剂量组血清ALT活性明显降低（P＜0.05），实验结果表明柳蒿提取液对四氯化碳致小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用。

表4 柳蒿提取液对CCl4致肝损伤小鼠血清中AST和 ALT 活力的影响（，n=10）

表4 柳蒿提取液对CCl4致肝损伤小鼠血清中AST和 ALT 活力的影响（，n=10）

*表示与模型组比较，P＜0.05；**表示与模型组比较，P＜0.01；## 表示与空白组比较，P＜0.01

组别 剂量（mg/kg） AST(U/L) ALT(U/L)空白组 - 19.020±3.183 11.143±1.227模型组 - 48.148±2.844## 41.370±1.605##联苯双酯组 100 39.773±1.675** 35.855±2.785**高剂量组 200 40.963±3.379** 37.553±3.357*中剂量组 100 42.228±4.195* 39.225±1.603低剂量组 50 44.998±4.065 40.100±1.812

3.8 柳蒿提取液对四氯化碳致肝损伤小鼠肝组织中T-SOD、T-AOC、GSH-Px、MDA 的影响

由表5数据可知，与空白组相比，模型组小鼠肝组织中T-SOD、T-AOC、GSH-Px水平显著降低，而肝组织中MDA含量显著增加（P＜0.01），表明小鼠急性肝损伤造模成功。与模型组相比，柳蒿提取液高剂量组小鼠肝组织中T-SOD水平显著增加 （P＜0.01），柳蒿提取液高剂量组小鼠肝组织中T-AOC水平显著增加（P＜0.05），柳蒿提取液高剂量组、中剂量组小鼠肝组织中 GSH-Px水平显著增加（P＜0.05；P＜0.01），柳蒿提取液高剂量组、中剂量组小鼠肝组织中MDA水平显著降低（P＜0.05；P＜0.01），实验结果表明柳蒿提取液对四氯化碳致小鼠肝损伤具有一定的保护作用。

表5 柳蒿提取液对CCl4致肝损伤小鼠肝组织中T-SOD、T-AOC、GSH-Px、MDA的影响(，n=10）

表5 柳蒿提取液对CCl4致肝损伤小鼠肝组织中T-SOD、T-AOC、GSH-Px、MDA的影响(，n=10）

* 表示与模型组比较（P＜0.05）；## 表示与空白组比较（P＜0.01）；** 表示与模型组比较（P＜0.01）

组别 剂量（mg/kg） T-SOD(U/mg) T-AOC(U/mg) GSH-Px(μmol/g) MDA(μmol/g)空白组 - 389.377±4.021 3.068±0.122 165.102±2.667 5.498±0.224模型组 - 254.514±2.096## 1.366±0.070## 114.410±1.008## 9.209±0.152##联苯双酯组 100 267.389±8.131** 1.683±0.153** 118.030±1.542** 6.065±0.111**高剂量组 200 265.151±6.788** 1.583±0.153* 117.990±1.084** 8.619±0.102**中剂量组 100 261.775±2.239 1.508±0.050 117.237±0.703* 8.821±0.122*低剂量组 50 258.177±3.860 1.452±0.047 114.659±0.857 9.061±0.362

4 讨论

课题组考察了超声提取及加热回流两种提取方法，同时分别考察了不同提取溶剂（甲醇、80%乙醇、50%甲醇、50%乙醇）对提取效果的影响，以色谱峰个数及含量为指标，最终确定80%乙醇溶液超声提取30 min制备供试品溶液。此外，考察了Zorbax SB-C18、Kromasil C18及Inertsil ODS-3色谱柱对样品分离结果，表明Zorbax SB-C18和Kromasil C18色谱柱分离效果较差，色谱基线漂移严重，而Inertsil ODS-3色谱柱各成分分离效果好，基线平稳。因此，色谱柱选择Inertsil ODS-3。

CCl4肝损伤模型常用来研究保肝、护肝药物的药效及其作用机制。对于CCl4引起的肝损伤机制存在多种意见，但都一致公认，自由基的形成及引发的链式过氧化反应，能够造成肝细胞膜结构的破坏与功能的完整性，使细胞质内ALT、AST等酶溢出[15]。目前，在抗肝脏疾病的药物研究中，各种黄酮类化合物对化学性肝损伤、药物性肝损伤、酒精性肝损伤等均有不同程度的保护作用。这种保护作用与黄酮化合物清除自由基、抗氧化、抗脂质过氧化反应等有着密切的关系。

血清中ALT和AST活性变化，常用来反映CCl4造成急性肝损伤的程度。AST活性增高，提示肝细胞线粒体受损伤；ALT活性增高，提示肝细胞膜破坏和细胞膜通透性增加[16]。本实验结果显示，柳蒿总黄酮高剂量组和中剂量组小鼠肝细胞损伤程度明显减少，血清ALT、AST水平显著低于CCl4模型损伤组，且具有剂量依赖性，提示柳蒿总黄酮具有保护肝细胞膜，对抗肝损伤的作用。

体内活性氧的过度激活、脂质过氧化反应的引发和持续是肝细胞损伤的重要病理基础之一[17]。MDA常用作脂质过氧化的指标，可严重破坏细胞膜的结构，导致细胞肿胀、坏死，其含量反映了组织过氧化的损伤程度[18]；SOD作为抗氧化酶，能清除体内自由基、抑制自由基反应，是抗氧化的第一道防线[19]；GSH-Px是一种重要的催化过氧化氢分解的酶，能特异性地清除机体活性氧，减轻和阻止活性氧的过氧化作用，是机体重要的抗氧化剂[20]。本实验结果表明，模型组小鼠肝脏SOD抗氧化酶活性降低，脂质过氧化水平升高，表明急性肝损伤小鼠肝细胞存在一定程度的损伤和氧化应激。柳蒿总黄酮可改善肝脏氧化应激状况，能够抑制肝组织中MDA升高而减轻肝脏损伤程度。柳蒿总黄酮给药组小鼠肝组织SOD、GSH-Px、T-AOC活性显著提高，表明其具有增强肝脏抗氧化能力的作用。

综上所述，本方法操作简便，灵敏度高，重现性好，可用于柳蒿药材中绿原酸、芦丁、木犀草苷、槲皮素含量的同时测定。此外，柳蒿具有保肝活性，其机理可能是通过抑制自由基脂质过氧化作用，保护细胞膜的完整性，降低血清ALT和AST两种酶的活性而发挥保肝作用。本研究为柳蒿资源的充分开发利用提供一定的参考依据.