桔梗的组织培养及抗盐碱性研究

王士杰,李晨光,何 颖,冯淑月

(吉林农业科技学院中药学院·吉林吉林·132109)

桔梗是常用的大宗中药材,主产于我国东北、华北、华东、华中等地区，在国内各个地区也均有不同面积种植[1,2]。其根入药,为药食两用品种，具有很好功效营养价值及观赏性的。桔梗的药用价值比较高，桔梗饮片可用于咳嗽痰多，胸闷不畅。植物组织培养技术不断完善,受到植物培育研究的广泛关注,并得到迅速发。无土栽培技术研究在我国起步还比较晚,香石竹(Dianthus caryophyllus)、唐菖蒲 (Gladiolus gandavensis)、菊花等花卉无土栽培试验的成功为我国无土栽培打下了坚实的理论基础[3]。以桔梗种子做为试验材料，一定条件下催芽，再以白花桔梗和紫花桔梗幼芽为材料，建立了愈伤培养、诱导生芽生根等一整套完整的抗性培养植株再生模型，培养具有抗盐性基因的桔梗苗木。该研究为丰富桔梗品种和快速培育桔梗提供理论基础。

1 实验材料

1.1 实验材料

白花桔梗和紫花桔梗种子实验材料在吉林农业科技学院左家校区桔梗种植基地采集。

1.2 试验仪器

752紫外可见分光光度计（上海奥普勒仪器有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海三发科学仪器有限公司）、超净工作台SW-CJ-2FB（苏州净化有限公司）等。

2 试验方法

2.1 培养基制备

MS、N6培养基配制。

2.2 幼芽的培育

选择色泽饱满的白花桔梗种子和紫花桔梗种子，放在温水中浸泡过夜后捞出，放在烧杯中，烧杯中放上湿的棉花为种子提供水分，将烧杯放在（25±1）℃的恒温箱中，每天用恒温水冲洗数次通风，进行催芽处理，半个月左右，等到种子长出5cm左右幼嫩的芽进行备用。

2.3 幼芽的接种

将白花，紫花桔梗幼嫩的芽切块（约2～5cm），用自来水反复清洗备好的幼芽20min，用洗衣粉水消毒15min，经消毒的幼芽，放在超净工作台中，吸干表面水分用滤纸，将白花、紫花桔梗幼芽材料分别接中于不同的培养基中，不同的培养基中接6瓶，每瓶5株，在温度 （25±1）℃的温度下培养，光照强度为2500～3000lx,光照时间长为12h的条件下培养15天左右，对其发芽数进行记录，以下步骤组培条件同此条件一致。

2.4 诱导愈伤

以接种处理中最佳的培养条件为基本培养基，在不同浓度IBA和NAA的条件下，分别对白花桔梗和紫花桔梗进行诱导，得出适于愈伤组织分化明显的实验组。得出诱导效果好的一组处理。待生长稳定后接种到含有不同盐培养基中进行抗盐筛选。

2.5 生根培养

以诱导培养最佳的培养条件为基本培养基，培养30天左右记录生根情况，对白花桔梗和紫花桔梗培养基中的生根数、生长势等进行测量。

2.6 移栽培养

观察白花桔梗和紫花桔梗组培苗生根情况对其组培苗进行筛选，通过观察白花、紫花桔梗苗的生长势、叶片颜色、苗的长势进行筛选，筛选出各项物理指标较高的白花桔梗和紫花桔梗苗木。把白花桔梗和紫花桔梗苗木从培养瓶中取出后，将根部多余培养基用清水清洗干净防止杂菌和蚊虫滋生。然后将白花桔梗和紫花桔梗组培苗木移栽到(草炭:蛭石 =1:1)育苗盘中，土壤整平，以株距6cm×6cm进行栽培。栽完后放在室内，放置在防曝晒、遮阴、保暖的温室内，并保持温室内湿度适当。晚间温度过低适当保温，控制温度在（25±1）℃，保持移栽温室的湿度在 80%～90%范围内。基质保持湿润无积水，每周喷一次除菌剂，注意通风。

2.7 脯氨酸含量的检测

称取白花桔梗和紫花桔梗材料各1g，剪碎，用移液枪准确吸取5%TCA2mL和微量石英砂，研磨至均匀状态，继续加溶液进一步研磨，将研磨均匀的桔梗材料置于离心管离心，取离心后上清液做为样品提取液。用移液枪准确吸取离心的桔梗材料上清液2mL(以蒸馏水为对照品)，用移液枪准确吸取配置好的TBA溶液2mL，摇至均匀。将试管放入沸水浴中煮沸后，取出冷却，置于离心机中高速离心15min，转速3000r/min，取上清液加入比色皿中于波长为532nm、600nm和450nm处测其吸光值，通过计算得出脯氨酸检测值。

3 结果与分析

3.1 培养基的筛选

由表1可知，不同桔梗在同种培养基上的生长情况大致相同，而同种桔梗在不同培养基上的生长情况差别很大，其中白花桔梗的发芽率为64%～82%，紫花桔梗的发芽率为47%～84%。培养在1/2MS培养基中的桔梗发育率最好，白花桔梗的发育率为82%，紫花桔梗的发芽率为84%，其生长状况良好，培养在MS培养基中的桔梗发芽率次之，分别为70%和71%,其生长状况一般，其他培养基培养的桔梗发芽率均低于70%，生长状况较差。所以，1/2MS培养基比较适合桔梗的培养，因此，以1/2MS培养基作为基本培养基模型进行愈伤组织的培养。

表1 白花和紫花桔梗在不同培养基上的生长情况

3.2 不同生长激素对诱导愈伤率的影响

表2是正以最佳培养基1/2MS作为养基体系，加入生长激素NAA和6-BA，进行愈伤组织的处理培养。由表可知，相同浓度的激素处理的诱导愈伤率总体表现为：紫花桔梗＞白花桔梗，说明紫花桔梗对NAA和6-BA激素更敏感；不同浓度的NAA和6-BA对桔梗诱导愈伤率的结果不同，其中白花桔梗的诱导愈伤率为60.00%～86.67%，紫花桔梗的诱导愈伤率66.67%～90.00%。 0.3mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA处理的培养基中培养的桔梗诱导数较高，其中白花桔梗的诱导愈伤率达到86.67%，紫花桔梗的诱导愈伤率达到90.00%；0.2mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA处理的培养基中培养的紫花桔梗诱导数次之，诱导愈伤率达到80.00%，0.5mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA浓度处理的桔梗诱导愈伤率普遍偏低，白花的诱导愈伤率低至60.00%，紫花的诱导愈伤率低至66.67%。

表3 不同的盐在不同浓度下对桔梗成活率的影响

表2 培养基中不同浓度的NAA和6-BA对诱导愈伤率的影响

3.3 不同盐浓度及种类对桔梗成活率的影响

在以1/2MS培养基作为基本培养体系中，0.3mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA浓度的培养基中得到的桔梗苗木，愈伤组织接种到分别添加了0、2.5、5.0mg/L氯化钠、硫酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠培养基中进行盐胁迫处理。由表2可知，白花桔梗和紫花桔梗的成活率随着盐浓度的不断增加呈现显著下降趋势。在盐浓度为0mg/L时，桔梗的成活率在 80.33%～83.33%之间，长势良好；在盐浓度为 2.5mg/L时，桔梗的成活率在 72%～76%之间，长势一般；在盐浓度为 5.0mg/L时，桔梗的成活率在61%～69%之间，长势较差。

不同的盐处理的培养基中桔梗的成活率不同，在浓度为2.5 mg/L的培养基中，桔梗的成活率表现为：氯化钠＞碳酸钠＞碳酸氢钠＞硫酸钠；在浓度为5 mg/L的培养基中，桔梗的成活率表现为：碳酸钠＞碳酸氢钠＞氯化钠＞硫酸钠。

不同盐类胁迫对组培苗的成活率随盐浓度的增大而降低这一现象会因继代次数的增加而减弱，待组培苗生长到一定的高度进行移栽，移栽到(草炭:蛭石=1:1)育苗盘中，土壤整平，以株距6cm×6cm进行栽培，就可以得到抗盐性较高的组培苗。

3.4 盐胁迫对桔梗中脯氨酸含量的影响

植物体内脯氨酸的含量的大量积累是由于土壤中较高的盐浓度所导致，游离的氨基酸在植物体内能够调节调节渗透压，维持细胞膨压。表3是不同的盐在不同浓度下对桔梗脯氨酸含量的影响，在盐浓度为0mg/L时，白花桔梗中的脯氨酸含量在0.82～1.34mg/kg之间，紫花桔梗中的脯氨酸含量在0.89～1.19 mk/kg之间；在盐浓度为2.5mg/L时，白花桔梗中的脯氨酸含量在4.55～6.22mg/kg之间，紫花桔梗中的脯氨酸含量在4.38～5.62mk/kg之间；在盐浓度为5.0mg/L时，白花桔梗中的脯氨酸含量在9.43～10.32mg/kg之间，紫花桔梗中的脯氨酸含量在9.32～9.82 mk/kg之间。因此，随着盐浓度的增大，桔梗中的脯氨酸含量显著增多，桔梗对环境中盐的抵抗能力增强。

表4 不同盐浓度处理的桔梗中的脯氨酸含量

试验结果表明白花桔梗和紫花桔梗的最适培养基是1/2MS，最适的诱导继代培养基是1/2MS+0.3mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA，诱导继代培养基中加入不同浓度的盐进行抗盐筛选，这种抗盐性具有一定程度的稳定性，从而培养出能够更好的适应环境变化的桔梗品种。

盐浓度对桔梗发育率和生长的影响一些学者持有不同的观点，一般认为在盐成分诱导下，发芽的种子中可能存在一定的胁迫性的基因或特异的生理功能[4,5]，从而在环境中抵抗盐胁迫，或者在盐胁迫条件下抑制种子萌发，主要是由外界高渗透压导致种子吸水不足而引起的发芽率较低[6]。张娇[7]在氯化钠模拟盐胁迫对沙冬青种子萌发和幼苗生长的影响的研究中表明氯化钠对种子的萌发和胚根生长均产生抑制作用；管清杰[8]在相关研究中也表明，植物在遭受干旱、高温、高盐的情况下细胞内的动态平衡会被破坏，从而影响植株的生长和发育。这与本文中的研究结果相一致。

植物在盐胁迫条件下积累的主要渗透调节剂为脯氨酸，脯氨酸的含量是衡量植物抗逆性的主要生理指标[9]。因为脯氨酸对水具有很强的亲和力，是一种可溶性的氨基酸，所以可以平衡细胞内外的渗透压、保护植物细胞和酶含量。实验表明，当植物受到盐碱胁迫时，细胞内的保护性酶活性也会有不同程度增加，植物体内的脯氨酸为代表的渗透协调物质开始大量产生[10]。张伟丽[11]等人的研究结果也表明，植物体内脯氨酸含量随不同盐不同浓度的增加而增加,在一定程度下和盐浓度成正相关。

4 结论

桔梗在不同培养基上的生长情况表明，桔梗的最适培养基是 1/2MS，最适的诱导继代培养基是1/2MS+0.3mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA；在不同盐浓度胁迫的条件下，培养基中的盐浓度越高，桔梗的发芽率越低，生长状况越差，但随着继代培养次数的增加，桔梗的抗盐能力增强；桔梗中脯氨酸的含量随盐浓度的增加而升高，也说明盐的存在能够影响桔梗中氨基酸的含量，从而适应环境的改变。