响应面法优化假单胞菌产低温淀粉酶发酵培养基

王继莲， 任 羽， 李明源

(喀什大学 生命与地理科学学院 叶尔羌绿洲生态与生物资源研究高校重点实验室， 喀什 844006)

低温淀粉酶多由低温微生物分泌，可在室温环境下催化分解淀粉(包括糖原、糊精)分子内的糖苷键，且在0 ℃保持酶学活性[1-2]。相比同功能中温酶、低温酶的周转系数Kcat值和生理效率Kcat/Km值更高，但热稳定性较差[3]。综合认为，其适冷机制主要归因于分子内互作的减弱以及酶分子和溶剂间互作增强，并经过适当构象折叠提高酶分子柔韧性，提升了其与底物作用范围，减弱了自身活化能，从而提高低温催化性能，但同时也导致稳定性下降[4-7]。低温淀粉酶经适度加热即迅速失活，这种加热一般并不影响反应系统中其它酶活性，这在一些生产工艺如淀粉无蒸煮、食品保鲜方面非常有利。其在低温需求的医药化工方面也有一定的应用[8]。

目前，低温酶产生菌多存在酶活性不高且产量低的问题，导致生产成本高昂，成为制约其生产工艺规模化的瓶颈。为解决此类问题，可通过诱变、基因工程或进一步优化培养条件的方法获得高产且性质稳定的菌株。其中，培养条件优化多考虑单因素试验设计、正交设计以及响应面法等。响应曲面法(Response surface methodology，RSM)可通过分析相关回归方程探寻最佳参数水平组合，集成优化多变量问题。该方法以其界面简便直观、编码的回归方程拟合精度高、可优化评价诸多因素间主效应和相互作用等特点，在实验设计与结果表达方面更优良，广泛用于生物过程优化[9-12]。

项目组前期从东帕米尔高原冻土中分离鉴定一株产低温淀粉酶假单胞菌株Pseudomonassp.D5-2(GenBank登录号KU296965)[13]，但酶活力不甚理想，限制其进一步研究开发。为此，本研究在单因素基础上利用响应面法，借助Design Expert10软件，采用Box-Benhnken设计建立数学模型优化D5-2产酶培养基，以期提升酶活力，为后续深入阐释低温酶催化机理和工业应用提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

假单胞菌Pseudomonassp.D5-2[13]，分离自东帕米尔高原冻土层，最适生长温度15 ℃，最适生长pH 7.5，其所产淀粉酶粗酶最适催化温度25 ℃，热稳定性较差，最适反应pH 6.5。

1.1.2 培养基

种子培养基：LB培养基。

基础发酵培养基：葡萄糖5 g/L，酵母提取物10 g/L，pH自然。

以上培养基115 ℃高压灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化培养

将D5-2活化后，接种至5 mL 液体培养基中，摇床培养12～18 h即得种子培养液。将种子液按2%比例接入100 mL发酵培养基中，摇瓶发酵培养72 h。取一定体积发酵液，12 000 r/min离心10 min，所得上清为粗酶液。

1.2.2 淀粉酶活力测定

采用 DNS(3,5-二硝基水杨酸dinitrosalicylic acid)法[14]测定上清液粗酶活力。

在pH 6.0，25 ℃条件下，每毫升酶液每分钟分解释放出1 μg葡萄糖所需酶量定义为 1个活力单位(U)，记为U/mL。

1.2.3 单因素试验

1)碳源种类及浓度对酶活力影响。以10 g/L不同种类碳源(果糖/蔗糖/麦芽糖/乳糖/玉米粉)替代基础发酵培养基中的葡萄糖，其余条件不变分析酶活力差异。将基础发酵培养基中的乳糖浓度分别调整为5、10、15、20、25和30 g/L，考察不同浓度乳糖对菌株产酶活力影响。

2)氮源种类及浓度对酶活力影响。以10 g/L不同种类氮源(胰蛋白胨/牛肉膏/酪蛋白/尿素/硫酸铵)代替基础发酵培养基中的酵母提取物，其余条件不变分析酶活力差异。将基础发酵培养基中的胰蛋白胨浓度分别调整为5、10、15、20、25和30 g/L，考察不同浓度下的菌株产酶活力。

3)无机盐种类及浓度对酶活力影响。在基础发酵培养基中，分别添加1 g/L的不同盐离子(Na+/ K+/ Mg2+/ Mn2+/ Cu2+)，其他条件不变分析酶活力差异。将基础发酵培养基中的Cu2+浓度分别调整为0.5、1、1.5、2、2.5和3 g/L，考察不同浓度下的菌株产酶活力。

1.2.4 响应面分析法优化发酵产酶培养基

根据单因素结果，以对菌株产酶影响最大的乳糖、胰蛋白胨和CuSO43个因素为自变量，借助Design-Expert 10统计软件，通过Box-Benhnken设计优化培养基组分，测定相应酶活力，具体水平见表1。

表1 响应面分析中各因子和水平

1.2.5 模型拟合及统计分析

对所得结果进行二次回归拟合及方差分析检验，得出各变量最佳参数。模型及因素的显著性统计意义通过F值考察，所有试验均做3个平行。

1.2.6 模型验证

按照模型最佳参数进行验证实验，检验模型的可靠性，分析最终优化结果。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 碳源种类及质量浓度对产酶的影响

碳源种类、浓度在相关代谢产物生产过程中扮演重要角色，对产酶起到诱导作用。由图1可知，乳糖的诱导作用最显著，酶产量为85 U/mL。其次是麦芽糖和玉米粉，这可能与其蛋白酶系组成有关，其他碳源促进效果不明显，因而选择乳糖作为最佳碳源。

图1 不同碳源对Pseudomonas sp.D5-2产酶影响

图2 乳糖浓度对Pseudomonas sp.D5-2产酶影响

随乳糖浓度增加，酶活力先升高后降低，在15 g/L时酶活力最大为90 U/mL。继续增加浓度，酶活力开始下降，可能产生了阻遏效应。

2.1.2 氮源种类及质量浓度对产酶影响

氮源为微生物合成含氮代谢物提供相应来源。由图 3可知，有机氮源比无机氮更适宜产酶，尤以胰蛋白胨促进作用最显著，其次是牛肉膏。而无机氮源硫酸铵则抑制了酶活。推测原因可能是有机氮源含有不同结构碳架，利于供给较多合成前体，营养更周全，导致菌体新陈代谢比较旺盛。而无机氮源结构简单，发酵早期即被作为速效型氮源迅速利用，被消耗殆尽后造成发酵液pH值降低，影响细胞膜各种成分运输和粗酶合成。

图3 不同氮源对Pseudomonas sp.D5-2产酶影响

胰蛋白胨浓度对产酶影响较大，浓度为10 g/L时酶活力最高，浓度继续增加，酶活力受到抑制开始下降，因此最佳浓度为10 g/L。

图4 胰蛋白胨浓度对Pseudomonas sp.D5-2产酶影响

2.1.3 无机盐种类及质量浓度对产酶影响

无机盐可调节细胞渗透压，维持菌体细胞的等渗作用，或作为辅酶或酶的组成部分，或激活菌体中的酶促进细菌生长繁殖。由图5可知，Cu2+对菌株产酶激活最明显，其次是Na+，其余离子不利于发酵产酶。可能是Cu2+参与了该淀粉酶酶蛋白组成。

图5 无机盐对Pseudomonas sp.D5-2产酶影响

Cu2+浓度为1～2 g/L时菌株产酶活力旺盛，趋于稳定状态，其中2 g/L时酶活力最高。低于或高于此浓度，菌株产酶受到抑制。

图6 Cu2+浓度对Pseudomonas sp.D5-2产酶影响

2.2 响应面结果分析

2.2.1 试验方案及回归模型

根据单因素确定的对酶活力影响较大的自变量，设计3因素3水平响应面试验，分析各因素主效应及交互作用，结果见表2。

表2 响应面试验方案及结果

用Design Expert 10方差分析模块得到酶活力(Y)与乳糖浓度(A)、胰蛋白胨(B)、硫酸铜浓度(C)编码水平下的二次响应面回归模型Y=+95.86+2.27A+2.74B+1.91C+2.75AB+2.80AC+0.63BC-3.67A2-3.49B2-3.04C2。式中A、B、C各项系数绝对值的大小直接反映其对淀粉酶活力指标值的影响程度，系数正负表示影响作用趋向。

2.2.2 方差分析

模型一次项A、B、C差异极显著，表明乳糖、胰蛋白胨和硫酸铜浓度均可极显著影响菌株发酵产酶。二次项A2、B2、C2显著，说明酶活力与乳糖、蛋白胨、Cu2+浓度不是简单的线性关系；交互作用项中AB、AC、BC的P值分别为<0.0001、<0.0001、0.0692，表明胰蛋白胨和乳糖、硫酸铜交互作用均显著，而乳糖和硫酸铜交互作用不显著。

综合F值大小或方程一次项系数绝对值大小，确定各因素对酶活力影响为胰蛋白胨>乳糖>硫酸铜。

表 3 回归模型方差分析

2.2.3 响应面分析

1)乳糖和胰蛋白胨交互作用。固定Cu2+浓度为2 g/L，当乳糖浓度为10～20 g/L、胰蛋白胨5～15 g/L时，酶活力呈现先升高后降低趋势，说明二者浓度过高或过低都不能使酶活力最大，只有它们取某适中值时才可达到最高值。

胰蛋白胨浓度曲面较乳糖平缓，说明胰蛋白胨对酶活力影响更大。等高线性状反映出两因素间交互作用强弱，椭圆形说明二者间交互作用较强，圆形则无交互作用。图7等高线图为椭圆形，说明二者交互作用对D5-2产酶影响显著。

图7 乳糖和胰蛋白胨浓度对酶活力影响的响应面以及等高线图

2)乳糖和硫酸铜交互作用。图8为胰蛋白胨浓度10 g/L时，乳糖和Cu2+浓度对酶活力影响的等高线及响应面图。等高线图呈现椭圆形，说明两者交互作用较强。乳糖浓度曲面较硫酸铜曲面变化较为平缓，说明乳糖浓度对酶活力影响大于硫酸铜。

图8 乳糖和硫酸铜浓度对酶活力影响的响应面以及等高线图

3)胰蛋白胨和硫酸铜交互作用。固定乳糖浓度为15 g/L，当硫酸铜浓度在1.5～2.5 g/L时，酶活力呈现先增大后减小趋势。等高线呈椭圆形，说明胰蛋白胨和硫酸铜浓度的交互作用对酶活力影响显著。胰蛋白胨浓度曲面缓于硫酸铜，说明胰蛋白胨浓度对酶活力影响程度高于硫酸铜。

图9 硫酸铜和胰蛋白胨浓度对酶活力影响的响应面以及等高线图

2.3 验证实验

预测最优培养基组分为乳糖浓度19.715 g/L，胰蛋白胨浓度14.191 g/L，硫酸铜浓度2.417 g/L，此条件下，酶活力为98.876 U/mL。将上述模型根据实际情况修正参数后(调整乳糖19.7 g/L，胰蛋白胨14.2 g/L，硫酸铜2.4 g/L)进行3次重复实验，结果酶活力为99.7、99.6和98.4 U/mL，平均99.2 U/mL。实测值接近模型预测值，表明回归模型与实际情况拟合良好，方程可信度较好。

3 讨论与结论

科学的培养基组分和配比不仅促进菌体快速生长繁殖，增强微生物的代谢性能，也能提高能源利用率，降低控制生产成本。现代数学中的很多统计优化技术逐渐渗透到微生物发酵工艺优化中[15-17]。高云航等[18]应用响应面法优化BacilluslicheniformisMX5产木质素过氧化物酶发酵条件，酶活达到最大值103.965 U/L。陈晓媛等[19]在单因素试验基础上，采用响应面法优化里氏木霉产纤维素酶发酵条件，最终羧甲基纤维素酶活力、微晶纤维素酶活力、纤维二糖酶活力和滤纸酶活力均得到提升。Sharma和Arora[20]利用响应面分析优化Phlebiafloridensis产木质纤维素酶发酵培养基中的含水量、NH4Cl及麦芽提取物含量，结果漆酶活力增加34倍。

在淀粉酶活力提升方面，也有诸多采用响应面优化菌株发酵条件的报道。但不同于本研究确定的最适碳源乳糖，氮源胰蛋白胨，无机盐离子Cu2+，王淑军等[21]对海洋细菌Pseudoalteromonassp.G23产低温淀粉酶的响应面分析表明，可溶性淀粉最利于其产酶，其次是糊精，而葡萄糖、蔗糖、纤维素则抑制菌株产酶。刘红飞等[22]对Pseudoalteromonassp.GS230发酵产低温淀粉酶的响应面分析显示，最佳碳源为可溶性淀粉，氮源为牛肉膏和蛋白胨，Na+、K+、Ca2+等能显著激活酶活力，但Cu2+强烈抑制淀粉酶活力。而库米拉·马吉提的分析表明[23]，枯草芽孢杆菌4-1产低温淀粉酶的最佳发酵无机盐离子为Ca2+。综上，不同培养条件对菌株产酶影响较大，推测原因可能与酶系组成有关，当然也可能受到菌株种属特异性及分离地域影响。

本研究通过建立连续变量三维曲面模型，对影响D5-2发酵产低温淀粉酶的生物过程因子最佳水平和交互作用进行评价，以获得最优发酵条件，最终酶活力达99.2 U/mL。由于细胞行为和生物合成特性受环境因素影响较复杂，对大规模复杂工业环境的响应行为还需进一步研究，才能更全面支撑工业生物过程的优化与放大。