Ectoine高产菌株Halomonas sp. XH26的鉴定及紫外诱变选育

田 磊, 张 芳, 沈国平, 高 翔, 龙启福, 朱德锐

(青海大学 医学院 基础医学研究中心, 西宁 810016)

Ectoine(1, 4, 5, 6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidnecarboxylic acid, C6H10N2O2)即1, 4, 5, 6-四氢-2甲基-4-嘧啶羧酸，是一种氨基酸衍生物，广泛存在于嗜盐古菌、嗜盐细菌、盐藻及真菌等胞内[1]。Ectoine是一种抵抗外界高盐环境的有机相容性溶质，具有增强酶活性、稳定DNA结构及保护蛋白质的功能[2]。国内外诸多文献报道，已将其广泛地应用于消化道疾病、干眼综合征、过敏性鼻炎、皮肤创伤与保健美容等生物医学领域[3-4]，其研发产品涉及消化道药物、滴眼液、鼻喷剂、皮肤创伤药及新型生物化妆品等[5-6]。目前，Ectoine大规模生产主要以微生物发酵为主，模式菌株主要有盐单胞菌属(Halomonas)与色盐杆菌属(Chromohalobacter)，如H.elongata(DSM 2581T、1A01717与BK-AG18)和C.salexigensDSM 3043T等[7-8]。相关研究主要集中于菌株优选和发酵工艺与条件的优化。Ectoine的发酵工艺主要包括实验室条件下的单批次发酵(试管液体培养、浅层液体培养、摇瓶培养与台式发酵罐等)，中试或工业级大规模生产(分批发酵罐法、流加发酵罐法与细菌挤奶Bacterial milking)等，或采用不同发酵方式联用，以提高Ectoine产量[9]。

针对Ectoine积聚菌株的研究，主要集中在野生菌株的分离筛选、基因工程菌株的构建(生物合成Pathway基因和ectABC操纵子等)、模式菌株代谢流量控制发酵(Metabolic overflow，包括Carbon-limited fed-batch cultures、Metabolic flux analysis与Metabolic flux distribution)及优化[10-12]。然而，以上不同的研究方法，各具优劣，其总体产量提高30%～79%[13-14]。参考其他微生物代谢产物的菌种改良研究，原始菌株的生产能力可通过物理(紫外诱变)或化学(硫酸二乙酯和甲基磺酸乙酯等)突变方式大幅度提高。紫外诱变[15](UV mutagenesis)是一种经典微生物诱变方法，菌株对诱变因素极具敏感性，且正向突变率高，能有效提高生产菌株的产量，然而国内外暂无Ectoine菌株诱变研究的相关报道。至此，本研究以小柴旦盐湖盐单胞菌Halomonassp. XH26为研究对象，采用9轮紫外线循环诱变选育遗传稳定的Ectoine高产突变菌株，以期为Ectoine大规模发酵生产提供新的菌源，提高Ectoine的发酵生产效率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源与培养基

野生菌株Halomonassp. XH26来源于青海大学基础医学研究中心的保存菌株，该菌株分离于柴达木盆地小柴旦盐湖。OSM分离培养基[1](g/L)：NaCl 50.0 g，MgSO4·7H2O 20.0 g，柠檬酸钠3.0 g，KCl 2.0 g，CaCl20.2 g，细菌蛋白胨10.0 g，酵母抽提物2.0 g，调pH 7.5，固体培养基另加琼脂15.0 g。发酵培养基(g/L)：NaCl 60.0 g，MgSO4·7H2O 25.0 g，KCl 55.0 g，L-谷氨酸钠6.5 g和酶水解酪素7.5 g，调pH 8。

1.1.2 主要试剂与设备

NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、柠檬酸钠、酵母、L-谷氨酸钠、酶水解酪素和NaOH等分析纯(天津永大化学试剂公司)；乙腈(HPLC级, 美国Fisher scientific公司)；Ectoine 标准品(HPLC级 > 95%, 德国Fluka Analytical公司)；超净工作台(上海智城公司)；第三代变速组织研磨器(OSEY50型，北京天根公司)；低真空扫描电镜(JSM-561ULV型, 日本电子光学公司)；高效液相色谱仪(HPLC1260型，美国安捷伦公司)；色谱柱(Merck-SeQuant ZIC-HILIC，150×4.6 mm，5 μm)；恒温摇床(ZD-85，上海精达公司)；微孔过滤器(0.22 μm水系，天津亳津公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化与菌悬液的制备

菌株活化。将Halomonassp. XH26菌株接种于5 mL OSM培养基中，160 r/min，35 ℃恒温振荡培12 h活化，测定OD600值，大量接种备用。菌悬液的制备：取上述对数生长期的菌液5 mL，3000 r/min 离心10 min，弃清液，加入0.9%的无菌生理盐水振荡洗涤3次，后重悬于生理盐水中，调整菌悬液浓度约为108CFU/mL[16]。

1.2.2 产Ectoine菌种的鉴定

将菌株接种于OSM固体培养基上，35 ℃培养24 h，观察菌落形态，革兰染色，在光学显微镜下观察菌体形态，参照《微生物学实验》《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰氏鉴定细菌学手册》对菌株进行生长特性与生化鉴定[17]。16S rRNA基因测序分析由上海生工生物工程公司完成，运用BLAST搜索同源序列，通过软件Mega v 7.0构建系统发育树[18]。

1.2.3 细菌电镜样品的制备

细菌处理和固定。细菌过夜培养后，取2 mL菌液(OD600约1.20)，8000 r/min离心3 min，弃上清；加入500 μL PBS洗2～3次，3000 r/min离心3 min，弃上清；加入2.5%戊二醛，混匀，4 ℃过夜固定。乙醇梯度脱水：固定处理液，8000 r/min离心1 min，弃上清，PBS溶液清洗3次，按30%～90%浓度梯度脱水；每次加入乙醇脱水后静置15 min，8000 r/min离心1 min后100%乙醇洗涤2次，条件同前；最后用乙酸异戊酯置换2次，每次20 min，最后一次3000 r/min离心3 min，弃上清；沉淀物经-20 ℃、-40 ℃与-80 ℃分别冷冻6 h后，在-65 ℃低温干燥箱中冷冻干燥12 h，粘样电镜检测[19-20]。

1.2.4 紫外诱变

将108CFU/mL菌悬液稀释为10-3、10-4、10-5与10-6浓度，各取5 mL稀释液置于90 mm的培养皿中，放入无菌磁力搅拌子，后置于磁力搅拌器上，在紫外灯下(功率25 W，照射距离30 cm，提前预热30 min)分别照射10～70 s(间隔10 s)。取照射后的菌悬液0.1 mL均匀涂布平板(每梯度3～5个)，以未经照射的菌悬液为对照，后将平板置于35 ℃培养箱，培养48 h计数致死率和正突变率。紫外诱变后选取菌落较大、长势良好、菌落边缘黏稠且不易拉丝的突变菌株，接种于发酵培养基中培养36 h，测定Ectoine产量。采用9轮循环紫外照射进行诱变，每轮诱变后连续培养3次，筛选Ectoine产量最高菌株进行下一轮诱变。正突变率(%)=正突变株数/诱变后菌落数×100%；致死率(%)=(对照CFU-处理CFU)/对照CFU×100%[21-23]。

1.2.5 细胞干重测定(CDW g/g)

将100 mL发酵液4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，弃上清，再加10 mL的生理盐水快速洗涤，8000 r/min 离心5 min，弃上清，将沉淀放于70 ℃烘干箱至恒重，干燥后称量，计算细胞干重(CDW g/g)。

1.2.6 Ectoine的提取

菌株发酵培养36 h后测OD600，12 000 r/min离心5 min，弃上清；加入99%的乙醇10 mL，用组织研磨器高速研磨3～4 min，12 000 r/min离心5 min，取出上清至10 mL烧杯中，放入60 ℃烘干箱中烘干4 h；再加入2 mL超纯水，重溶Ectoine后经0.22 μm水系微孔过滤器过滤，即为Ectoine提取液。

1.2.7 高效液相色谱(HPLC)检测Ectoine含量

配制1.0 mg/mL的Ectoine标准品母液(间隔0.2 mg/mL)，通过高效液相色谱(HPLC)检测Ectoine含量，采用高效峰面积和浓度制作标准曲线。HPLC检测条件：乙腈为流动相，检测波长210 nm，流速为1.0 mL/min，柱压3.486～4.761 MPa，柱温30 ℃，胞内Ectoine抽提液上样量10 μL[24-25]。

1.2.8 遗传稳定性

2 结果与分析

2.1 Halomonas sp.XH26菌体形态特征与同源性比对

Halomonassp.XH26菌株在OSM培养基上，菌落形态呈圆形(图1-A)，大小适中，易粘连，乳白色，隆起，湿润状，边缘规则，不透明，革兰氏阳性菌(图1-B)。电镜下菌体形态呈长杆状(图1-C)，略带弯曲，菌体的长度为(3～5)μm×(0.5～0.8)μm，两端圆润，无鞭毛。生理生化试验结果如表1所示。利用NCBI Blast分析比对XH26的16S rRNA基因序列，构建系统发育树(图2)。分析表明：菌株XH26位于盐单胞菌属进化分支单元，与嗜碱盐单胞菌H.alkaliphila2B8N(JF710970)和美丽盐单胞菌H.venustaDSM 4743(NR042069)类聚，进化趋近同源；XH26与H.alkaliphilaMAT-16(KC354706)、H.venustaB19b(JF710983)、H.alkaliphilaR4(KX495192)的相似性均为99%，进化高度同源，但在系统发育方向上，3者之间具有明显的差异。由图2可知，菌株XH26与HalomonascampaniensisLS21(CP007757)亲缘关系近，结合上述的生理生化鉴定结果，可将菌株XH26鉴定为Halomonascampaniensis。

2.2 紫外诱变最佳诱变时间的确定

紫外线照射时间对菌株的致死率和正向突变率的关系如图3所示。当紫外照射时间为50 s后菌株致死率达到80%以上，70 s以后菌株致死率达到了100%。随紫外照射时间的延长，菌株的正突变率也在增加。由于短时间照射不能达到较稳定的突变状态[24]，按照诱变剂量选择的一般原则[15]，致死率为70%～80%的剂量，菌株突变性可以保持在较稳定的水平。当紫外线处理50 s时致死率为75%，至此本研究选取50 s为最佳诱变时间。

表1 Halomonas sp. XH26的生理生化特征

A：菌落形态；B：革兰氏染色油镜(×100)；C: 扫描电镜(×10 000)，电压15 kV，工作距离WD12 mm，Bar 1μm)

图2 菌株XH26的系统发育树

图3 紫外线照射时间对菌株的致死率和正突变率的影响

2.3 产物鉴定结果

采用高效液相色谱法(HPLC)绘制标准曲线(图4-A)对突变菌株产物进行分析。Ectoine标准品检测结果如图4-B所示，选取突变菌株HU09-32提取Ectoine(图4-C)。通过高效液相色谱图比对，表明利用乙醇抽提突变菌株胞内产物和Ectoine标准品的校正保留时间均为10 min，完全一致，应为同一物质，确定突变菌株能够积累Ectoine。

A：Ectoine标准曲线；B：标准品吸收峰型；C：突变菌株HU09-32提取Ectoine吸收峰型

2.4 紫外诱变突变菌株筛选

经过9轮循环诱变，得到272株突变菌，最终筛选出7株Ectoine产量较高的突变菌株(表2)。由表2可知，诱变菌株HU09-6、HU09-12及HU09-71的Ectoine产量相当，分别为原始菌株的2.1、2.4及2.1倍，HU09-21、HU09-61与HU09-62菌株Ectoine产量分别为1154.29、1165.16与1202.98 mg/L，其中HU09-32菌株Ectoine产量最高，达到1351.09 mg/L，为原始菌株的2.9倍，具有显著差异(P< 0.05)。因此，选取HU09-32菌株作为后期研究的目标菌株。

表2 紫外诱变突变菌株Ectoine产量

2.5 突变菌株稳定性检测

选取Ectoine产量在950 mg/L以上的7株突变型菌株：HU09-6、HU09-12、HU09-21、HU09-32、HU09-61、HU09-62与HU09-71进行连续培养，HPLC检测Ectoine产量。结果分析(表3)表明：通过40 d连续培养(接种2 d/次)后，7株突变型菌株Ectoine产量均未出现明显降低，每组实验结果无明显差异，表现出一定的遗传稳定性，且均明显优于原始菌株。HU09-12、HU09-21与HU09-61稳定性较好，Ectoine产量保持在1000 mg/L左右。HU09-6和HU09-71菌株Ectoine产量较稳定，但是在30 d后出现轻度降低的趋势。HU09-32和HU09-62的稳定性最好，Ectoine产量均未低于1200 mg/L，具有发酵生产应用潜力。

表3 突变株遗传稳定性的测定

3 讨论与结论

Ectoine工业生产的关键问题在于菌株的分离与选育，目前研究主要集中在野生菌株的分离筛选、发酵条件的优化及构建基因工程菌株[10-11]。周月慧等[27]单批次摇瓶发酵HalomonasvenustaSL 21(48 h)，诱导生成的Ectoine产量为285.1 mg/L。张晓梅等[28]实验室摇瓶发酵Halorubrumaidingense菌株，显示Ectoine的最大产量为321.28 mg/L。Becker等[29]将伸长盐单胞菌(H.elongata)的Ectoine合成基因簇ectABC整合到谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的基因组，构建基因工程菌，经分批补料发酵Ectoine的产率为6.7 g/L·d。对比以上研究，Ectoine产量均在不同程度上获得提升，但是增长有限。目前，国内外暂无对产Ectoine菌株进行物理或化学方法诱变处理，来获得高产Ectoine突变菌株的研究报道。

基于紫外诱变是获得细菌突变体的经典方法，其诱变效应为引起细菌DNA结构或碱基序列的变化，导致基因发生突变[30-31]。目前，该方法广泛用于不同微生物发酵产物的研究中。张云野等[32]对休哈塔假丝酵母(Candidaalbicans)HDYXHT-01进行紫外诱变，获得的突变株乙醇产量提高3.03%～12.88%。刘俊梅等[21]采用紫外线和硫酸二乙酯相结合的诱变方法对P.koreensisPK3菌株进行复合诱变，获得一株高产PHB突变菌株，PHB产量达到15.94 g/L，较原始菌株提高了2.61倍。田连生和陈秀清[22]通过紫外线和甲基磺酸乙酯(EMs)对野生菌株XN-3进行复合诱变，选育突变菌株UH-2-4，其絮凝率达到96.8%，比出发菌株提高了25.1%。本研究通过比较紫外线处理时间对Halomonassp. XH26菌株与Ectoine产量的影响，发现紫外线处理50 s，能有效提高Ectoine的产量；同时，可以保持突变株胞内Ectoine产量的稳定。经9轮循环紫外诱变筛选，获得7株遗传稳定性较好的突变株，Ectoine产量均达到出发菌株2倍以上，其中HU09-32 Ectoine产量最高,为1351.09 mg/L±17.69 mg/L，是原始菌株Ectoine产量(Halomonassp. XH26发酵条件优化后，456.82 mg/L±15.72 mg/L，CDW 0.71 g/g±0.04 g/g)的2.9倍。

本次研究采取多轮紫外循环诱变，筛选获得Ectoine高产突变菌株(200%以上)。经过连续培养(40 d)，其Ectoine的产量表现出良好的稳定性，显示出很好的生产和应用前景。但实验中发现，随着诱变代数的增加，诱变菌株亦表现出生长速度降低、Ectoine产量减少及菌落形态改变等现象。在本实验中，获得7株突变株的Ectoine产量稳定，没有回复亲本菌株的迹象，明显优于原始菌株。后续我们将会在分子水平上对突变菌株与原始菌株产Ectoine基因进行探究，为进一步提升菌株性能提供可靠的实验依据与实验菌株。