嗜酸性粒细胞在大疱性类天疱疮发病机制中的作用及临床应用

盖晓磊，左亚刚

大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid，BP)是一种罕见的自身免疫性水疱性疾病，主要发生于老年人。目前病因和发病机制尚不清楚，BP是免疫球蛋白G(IgG)介导的疾病，自身抗体与位于基底膜带的2种半桥粒抗原(BP180、BP230)相结合，引起补体级联反应的激活、炎症细胞局部募集、炎症介质和蛋白酶释放、真表皮之间的连接蛋白破坏，导致基底膜带损伤、真皮-表皮分离，在正常皮肤或红斑基础上出现瘙痒性、紧张性水疱[1]。目前，遗传因素、药物、X射线、感染等因素认为是BP的触发因素。

多数BP患者存在抗BP180抗体，BP180是一种位于表皮和基底膜之间的跨膜糖蛋白，其胞外结构域NC16A，是BP的主要抗体结合位点[2]，多个动物实验亦证实抗BP180抗体为致病性抗体，其滴度与BP病情严重程度密切相关[3]。BP230是半桥粒胞内成分，存在于基底角质形成细胞内，IgG自身抗体与BP230的球状C末端结构域结合[4]，目前BP230与病情是否具有相关性仍有争议，可能与非典型BP相关[5]。除了IgG外，近年来，越来越多证据表明嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)和免疫球蛋白E(IgE)在BP发病过程中发挥着重要作用。EOS是IgE自身抗体介导水疱形成所必需的细胞[6]；50% BP患者外周血EOS升高[7]；EOS数量与未经治疗BP患者的病情严重程度呈线性关系[8]；被动转移抗基底膜带IgE自身抗体可导致红斑、瘙痒、EOS浸润和水疱的发生[9]。本文综述EOS在BP中的作用及临床应用研究进展。

1 EOS及其活性成分的特征和功能

1.1 EOS基本特征

众所周知，EOS来源于骨髓造血干细胞，在骨髓分化成熟后，进入血液循环，停留数小时后，在活性趋化因子作用下向组织器官迁移，正常情况下存在于胃肠道、肺、脂肪组织、胸腺、子宫和和乳腺等组织[10]，而皮肤含量较少。但在某些过敏性、感染性、自身免疫性以及肿瘤性疾病等病理情况下，皮肤中EOS会增高。EOS主要受到白细胞介素-5(IL-5)、嗜酸性粒细胞趋化因子-1(eotaxin-1)、IL-3和粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)的调节[11]。

1.2 EOS及其活性成分功能

EOS作为固有免疫细胞，主要与宿主防御有关，可维持机体免疫稳态。同时EOS是机体抗寄生虫、细菌感染和过敏反应时Th2为主的效应细胞。当寄生虫感染时，EOS被招募到组织中，释放其细胞毒性颗粒蛋白、某些细胞因子和脂质介质，EOS与毒性颗粒蛋白结合形成细胞外DNA诱捕网，导致寄生虫破坏，从而发挥抗微生物、寄生虫和抗肿瘤作用,但是释放的毒性颗粒，也会造成组织的损伤。当EOS被激活、脱颗粒后产生毒性颗粒和许多细胞因子和趋化因子，毒性颗粒包括主要碱性蛋白(major basic protein，MBP)，嗜酸性粒细胞过氧化物酶(eosinophil peroxidase, EPX)，嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素(eosinophil derived neurotoxin，EDN)和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP)[12]；细胞因子包括转化生长因子-β，白细胞介素(IL)-3、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16、IL-18,肿瘤坏死因子-α, CCL5和CCL11[13]。

MBP通过影响细胞表面电荷,改变细胞膜通透性，可造成细胞损伤[14]，同时对培养的角质形成细胞具有浓度依赖细胞毒性作用。ECP是一种细胞毒性核糖核酸酶，具有多种生物学和免疫调节功能，调节成纤维细胞活性、诱导气道黏液分泌、与凝血和补体系统相互作用等[15]。同时ECP是炎症敏感性指标，是EOS活化标记物，因其与病情严重程度有关，常用于炎症性、免疫性疾病的疗效评估、病情监测及预后判断。与ECP相比，EDN细胞毒性可能相对较低[16]。

在EOS缺乏、部分基因缺失的小鼠模型的研究中，EOS具有组织损伤、修复、重塑以及免疫调节作用[12]。

综上，EOS具有抗微生物、寄生虫和抗肿瘤，组织损伤、修复、重塑以及免疫调节作用等多种功能。

2 EOS及活性成分在BP中可能作用机制

2.1 EOS、ECP和EDN

EOS浸润是BP突出病理特征，在BP血清存在的情况下，EOS分布于真表皮交界处；在BP患者外周血、皮损中均可见EOS升高[7]；EOS脱颗粒主要发生在BP早期，红斑以及水疱前病变阶段[17]；EOS被激活后，脱颗粒的EOS黏附在基底膜角质形成细胞上，提示EOS颗粒可能直接破坏基底角质形成细胞导致真皮-表皮分离[18]；EOS聚集、活化、释放ECP，ECP带有正电荷，它与带负电荷的分子蛋白聚糖，硫酸乙酰肝素和脂质相互作用后，诱导细胞膜孔道、跨膜通道形成，破坏皮肤的完整性，造成组织、细胞损伤和水疱形成[19]；ECP可能通过线粒体依赖性途径诱导活性氧的形成和凋亡；BP患者血清、疱液中ECP、EDN浓度升高，其水平与疾病严重程度有关，ECP还能为BP预后判断提供参考[20-21]；BP患者疱液中ECP水平与疱液中凝血酶原片段F1+2和D-dimer呈线性关系，提示活化的EOS在皮肤水平可能启动凝血级联反应[22]。

以上研究均表明，EOS本身或是分泌的毒性颗粒均可能损伤角质形成细胞，从而造成皮肤或黏膜损害。

2.2 EOS和基质金属蛋白酶-9

在水疱部位，EOS可释放基质金属蛋白酶-9(metal metalloprotease 9，MMP-9)。MMP-9是以92 kDa酶原的形式从胞内分泌到胞外，在体内经一系列蛋白酶级联反应依次激活MMP-2、3、7、10、13而完成，主要功能是降解和重塑细胞外基质。目前国内外研究均表明MMP-9在BP中水疱形成的过程中具有重要作用，一方面可直接切割BP180抗原胞外结构域[23]，另一方面也可激活中性粒细胞弹性蛋白酶[24]，从而裂解BP180抗原，真表皮间基底膜带出现损害，从而导致皮损形成。在小鼠模型中，MMP-9通过灭活α1-蛋白酶抑制剂来调节中性粒细胞弹性蛋白酶活性，从而促进BP180降解以及基底膜带的分离[24]。在离体BP模型中，抑制白细胞弹性蛋白酶和MMP-9可抑制水疱生成[25]。ECP和EDN可上调角质形成细胞中MMP-9的表达。

2.3 EOS相关的其他细胞因子

在BP中，BP患者血清及疱液中IL-5明显升高，IL-5激活EOS可直接导致水疱形成，并且与病情严重程度相关[26]，IL-5可促进EOS生长、活化,而ECP可以诱导角质形成细胞产生IL-5，从而形成正反馈回路[27]，ECP也能够诱导角质形成细胞表达EOS趋化因子[27]，进一步增强正反馈回路，导致疾病发生发展。

瘙痒也是BP的主要特征，除了与嗜碱性粒细胞、组胺和神经肽等有关外，EOS本身及产生的IL-31也是与瘙痒相关的重要细胞及细胞因子，BP患者皮损和外周血中均可见高水平IL-31[28]，血清IL-31与外周血EOS、抗BP180 IgE抗体相关[29]，IL-31同时对EOS具有趋化作用，释放活性氧，趋化CCL26[30]。IL-31引起瘙痒的机制，可能通过IL-31RA(+)/TRPV1(+)/TRPA1(+)神经元亚群介导辅助性T细胞引起[31]，也可能通过JAK/STAT 传导通路，激活JAK-1、JAK-2、STAT-1、STAT-3和STAT-5[32]。EOS也可表达P物质、神经激肽1R等其它瘙痒介质[33]。P物质刺激表达神经激肽1R细胞,激活EOS,导致释放更多的瘙痒介质并引起瘙痒[34]。

EOS本身产生或表达的IL-31、P物质、神经激肽1R等物质，瘙痒介质也可能激活EOS，从而导致瘙痒症状产生及加重。

2.4 EOS和IgE

IgE主要由呼吸道和消化道黏膜固有层浆细胞产生，在正常人血液中含量极低，当血清IgE含量明显升高时，常提示遗传过敏体质或I型变态反应的存在。早期研究结果已表明BP患者皮肤基底膜带除了IgG抗体线状沉积外，还可见IgE抗体，但其作用机制尚不清楚。近期研究表明，70%～85%未经治疗BP患者可以检测到高水平循环总IgE抗体[35]，且循环总IgE抗体水平与疾病严重程度不相关，而且IgE水平不会随着病情缓解而下降[36]；而特异性抗BP180 IgE抗体水平与皮损面积或BP疾病面积指数评分(BPDAI)密切相关[37]。本课题组研究表明，总IgE抗体、抗BP180NC16A IgE抗体水平均与BP发病有密切关系, 且BP180 IgE水平与BPDAI中荨麻疹/红斑评分相关,而与水疱评分无关[5]；EOS是抗BP180 IgE抗体介导水疱所必需的细胞[6]；被动转移抗基底膜带IgE自身抗体可导致免疫缺陷小鼠出现红斑、瘙痒、EOS浸润和水疱的发生[9]；以上结果表明 IgE 自身抗体同样具有致病作用。IgE 可能与肥大细胞上的 FcεRI 受体相互作用，并通过结合 BP180 的 NC16A 结构域促进其交联，随后某些组胺和细胞因子脱颗粒，EOS趋化；此外，IgE还可以与角质形成细胞上BP180的NC16A结构域直接结合，导致IL-5、IL-6和IL-8的释放，从而募集更多的EOS[38]。

以上研究均表明，IgE与EOS二者之间具有千丝万缕的联系，IgE介导的EOS活化是间接通过组织肥大细胞进行的，而后释放EOS趋化因子或迁移介质；IgE本身具有致病性，通过激活EOS，导致水疱发生。

3 EOS在BP诊断治疗中的价值

3.1 EOS水平与病情严重程度密切相关

既往研究显示EOS与病情严重程度相关，与激素治疗最大剂量间具有线性关系[39]。在尚未开展抗BP180抗体检测的单位，可通过EOS水平初步评估、了解病情变化情况。

3.2 EOS相关生物制剂

IL-5单克隆抗体：美伯利单抗(mepolizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、贝那珠单抗(benralizumab)在国外已用于嗜酸性、重症哮喘的治疗。目前mepolizumab治疗BP的临床试验已经完成，但结果表明对BP疗效不佳[40]。reslizumab国外已开展BP治疗的临床试验(www.clinicaltrials.gov,NCT01705795)，有希望成为治疗BP的药物。柏替木单抗(bertilimumab),可靶向嗜酸细胞活化趋化因子-1(eotaxin-1)，从而抑制炎症反应，关于bertilimumab治疗中重度BP的Ⅱa期临床研究(www.clinicaltrials.gov, NCT02226146)也已经开展。

目前针对瘙痒介质的生物制剂已开展临床实验，度普利尤单抗(dupilumab)通过阻断IL-4Rα调节IL-4、IL-13通路的信号传导，有可能成为BP新的治疗药物[41]。奈莫珠单抗(nemolizumab)是IL-31RA拮抗剂，舍洛匹坦(serlopitant)是神经激肽1R拮抗剂[42-43],以上多用于特应性皮炎患者瘙痒的治疗，尚未见治疗BP的相关报道。

奥马珠单抗(omalizumab)是人源化单克隆抗体，因其可结合游离IgE，从而阻断IgE与其受体相互作用，在国外主要用于治疗重度哮喘和慢性荨麻疹，目前研究表明，该药与利妥昔单抗具有相似的疗效和安全性[44]。

综上所述，BP患者出现异常B细胞免疫反应，产生针对半桥粒蛋白BP180和BP230的IgG和IgE自身抗体，出现以EOS为主的炎细胞聚集，炎症细胞产生的IL-5等细胞因子激活，产生活性氧，形成EOS外捕获网和脱颗粒，释放ECP、MBP、MMP-9和IL-31，导致基底膜带降解，从而形成水疱和瘙痒症状，提示EOS在BP发病过程中发挥重要作用。此外，EOS与BP病情严重程度相关，可作为BP病情严重程度评估的指标。目前已出现针对EOS的生物制剂，相信不久的将来会成为BP有效的治疗手段。