超声辅助纤维素酶提取青龙衣多糖工艺条件优化

李 娜，赵文婧，燕平梅，武晓英，李会珍，李晓君

（1.太原师范学院生物系，山西晋中 030619；2.中北大学化学工程与技术学院，山西太原 030051）

青龙衣是胡桃科（Juglandaceae） 胡桃属（Juglands）植物核桃（Juglans regiaL.）和胡桃楸（Juglands mandshuricaMaxim.）未成熟的外果皮[1]，主产于东北、河北、山东、山西、陕西等地，以长白山野生青核桃皮最具药用价值[2]。青龙衣作为我国重要的药源植物[3]，含有多种活性成分，包括多糖类、萘醌类、多酚类、黄酮类、萜类、二芳基庚院类、挥发性成分等[4-5]，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌及解毒消热消肿等生物学功效[6-8]。

植物多糖是一类含有多羟基的极性大分子化合物，具有无毒、生物活性好、与细胞相容性好等优点[9]。研究表明，青龙衣中含有丰富的多糖类化合物，且其生物功效显著。Wang R等人[10]通过研究青龙衣水溶性多糖对S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用，结果表明，青龙衣多糖对S180细胞增殖具有显著的抑制作用，可以对S180荷瘤小鼠免疫功能起到保护作用。胡泽成[11]以不同浓度青龙衣多糖处理结肠癌HCT-116细胞，发现青龙衣多糖可以抑制PI3K/Akt信号通路的激活，并对HCT-116细胞的增殖具有显著抑制作用。近年来，由于青龙衣多糖具有显著的肿瘤活性，对青龙衣多糖的研究已经成为国内外学者的研究热点，国内外学者对青龙衣多糖化学成分及其生物活性的研究报道越来越多。

目前，国内外多糖的提取方法主要有传统水提-醇沉法、溶剂浸提法、热回流提取法、生物酶法、超临界流体法等[12-13]。王红霞等人[14]采用水提-醇沉法比较了不同品种、不同时期核桃青皮多糖的含量，结果表明，所有核桃品种外皮多糖含量均在硬化期达到最高。任晓蕾等人[15]采用响应面法对核桃青皮多糖提取工艺进行优化，结果表明当提取温度88℃，料液比1∶22，提取时间72 min时，多糖提取量可达7.83 mg/g。生物酶法成为近期天然产物提取的研究热点。通过酶解法将青龙衣组织结构和大分子物质破坏，再利用超声波强烈振动、空化效应、热效应和搅拌作用等[16]进一步破坏细胞组织，使植物组织细胞中的多糖充分溶出[17]，同时采用响应面法对提取工艺进行优化，从而提高提取效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青龙衣，于2019年7-8月购自山西省沁县。

葡萄糖（色谱纯）、DPPH（分析纯）、ABTS（分析纯）、纤维素酶（酶活力50 U/mg），国药集团化学试剂有限公司提供；其他有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 试验设计

单因素试验分别考查粉粹粒度（60，80，100，120，140目）、料液比 （1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50）、纤维素酶添加量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%）、超声时间 （20，40，60，80，100 min）、酶解温度 （25，35，45，55，65℃）、超声功率（200，400，600，800，1 000 W） 对青龙衣多糖提取量的影响。在单因素试验基础上，采用Design Expert 10.0.3.1、Box-behnken试验设计方案，选择料液比（X1）、超声时间（X2）、酶解温度（X3）、纤维素酶添加量（X4）为考查变量，以多糖提取量（Y）为响应值。

超声波提取青龙衣多糖响应曲面设计因素与水平设计见表1。

表1 超声波提取青龙衣多糖响应曲面设计因素与水平设计

1.3 青龙衣多糖提取量测定

将青龙衣洗净，置于50℃恒温干燥箱中烘干，粉碎、过筛，干燥备用。精密称取青龙衣粉末1.0 g，加入一定的纤维素酶量，依料液比加入蒸馏水，放入特定温度和超声功率的超声波清洗机中，酶解一定的时间；过滤提取液、沉淀、离心，取上清液备用；采用苯酚-硫酸法[15]测定多糖含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

粉碎粒度、料液比、纤维素酶添加量对青龙衣多糖提取量的影响见图1。

图1 粉碎粒度、料液比、纤维素酶添加量对青龙衣多糖提取量的影响

由图1可知，青龙衣多糖提取量随青龙衣粉碎粒度的增加而增加，当粉碎粒度超过100目后，多糖提取量逐渐降低，可能原因是随着粉碎粒度的增大，青龙衣粉末与提取溶剂充分接触，使多糖容易溶出，但随着粉碎粒度继续增大时，导致青龙衣物料过细，使青龙衣粉碎物极易吸附结块，从而增加了传质阻力，降低传质速率，不利于多糖的溶出[18]。因此，选择合适的粉碎粒度为100目。

由图1可知，青龙衣多糖提取量随料液比的增加而增加，当料液比超过1∶20后，多糖提取量趋于稳定，可能原因是随着液料比的增大，青龙衣多糖与提取溶剂的浓度差增大，提高了传质速率[19]，多糖更易溶出，随着料液比继续增大时，极大的浓度差导致青龙衣其他组分的溶出，使得多糖提取量的增加不明显。因此，选择合适的料液比为1∶20。

由图1可知，随着酶添加量的增加，青龙衣多糖提取量增加，当酶添加量超过1.5%时，多糖提取量增加缓慢。可能原因是，随着酶添加量的增加，植物组织在纤维素酶的作用下逐渐水解完全，有利于多糖的释放，从而提高多糖提取量；但随着酶添加量的继续增加，有限的底物浓度限制了多糖的溶出，或者多糖被包裹在纤维素酶中[20]，从而使得多糖提取量趋于不变。因此，选择合适的酶添加量为1.5%。

超声时间、酶解温度、超声功率对青龙衣多糖提取量的影响见图2。

由图2可知，随着超声时间的延长，青龙衣多糖提取量增加，但在超过50 min时，多糖提取量缓慢下降，可能原因是，随着超声时间的延长，青龙衣组织细胞被破坏得更加充分，有利于酶解的进一步作用，使多糖更易溶出，但随着时间的延长，持续高温可能在一定程度上对多糖分子的结构具有破坏作用，或者使多糖分解为单糖[21]，从而使得多糖提取量降低。因此，选择合适的超声时间为50 min。

图2 超声时间、酶解温度、超声功率对青龙衣多糖提取量的影响

由图2可知，随着酶解温度的升高，青龙衣多糖提取量逐渐增加，但当温度高于45℃以后，多糖提取量逐渐下降，可能原因是，试验所用纤维素酶的最适温度为45～55℃，随着酶解温度的升高，纤维素酶活性增大，酶解作用也相应增强，多糖提取量随之增加，但当试验温度超过酶的最适温度后，高温使得纤维素酶的活性逐渐降低，或者持续的高温使部分多糖降解[22]，从而导致青龙衣多糖的提取量下降。因此，选择合适的酶解温度为45℃。

由图2可知，随着超声功率的升高，青龙衣多糖提取量呈现先增加后降低的趋势，当超声功率为600 W时，多糖提取量最大为7.92 mg/g。原因可能是，适当功率的超声波对植物组织细胞具有破坏作用，有利于组织细胞间或细胞内有效成分的释放。但是，较大的超声功率极易造成多糖分子链的断裂，或者对组织细胞的破坏作用更彻底，从而使与目标成分存在萃取竞争关系的非目标物质溶出[13]，从而使得多糖提取量降低。因此，选择合适的超声功率为600 W。

各单因素试验中，综合考虑多糖提取量及试验成本等因素，确定粉碎粒度100目，料液比1∶20，纤维素酶添加量1.5%，超声时间50 min，酶解温度45℃和超声功率600W为青龙衣多糖的最佳基本提取条件。各单因素试验除粉碎粒度和超声功率外，不同条件对青龙衣多糖提取量的影响范围为2.02～3.70 mg/g，不同粉碎粒度和超声功率对多糖的影响范围分别为0.81，0.91 mg/g。因此，试验仅将料液比、超声时间、酶解温度、纤维素酶添加量列入响应面试验的优化因素中，而粉碎粒度和超声功率并未列入响应面优化因素中。

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面模型及显著性检验

将料液比、超声时间、酶解温度、纤维素酶添加量作为曲面响应法考查的4个单因子，以多糖提取量（mg/g）为响应值，四因子三水平29个组合的曲面响应法分析试验结果。多糖提取量的变幅为5.04 mg/g（8号试验） 到8.81%（1号试验）。

试验设计及响应值结果见表2。

2.2.2 多糖提取量的响应面分析

表2 试验设计及响应值结果

运用Design Expert 10.0.3.1软件对表2所示多糖提取量进行的试验数据的响应面回归拟合，得出多糖提取量响应值（Y）和各因素（X1，X2，X3，X4）间二次回归模型：

二次多项式模型的方差分析见表3。

由表3可知，试验各因素对多糖提取量的影响顺序依次为纤维素酶添加量>料液比>酶解温度>超声时间。

由表3可知，多糖提取量的二次多项式拟合模型极显著（p<0.000 1)，F值为21.28，其失拟项p=0.335 7>0.05不显著。因此，在试验范围内，此模型与试验数据的拟合性较好；拟合系数R2值是0.955 1，说明该模型能够阐明95.51%的响应值的变化。信噪比Adep Precision（14.406） 大于4，说明该模型的回归方程的可信度较高。变异系数为4.5，说明模型稳定性较好。由此可以看出，响应面法优化超声辅助酶解法提取青龙衣多糖的工艺可靠并且稳定性好，可以用该模型对料液比、超声时间、酶解温度、酶添加量对多糖提取量进行优化和分析。

表3 二次多项式模型的方差分析

由表3可知，料液比-酶添加量二次项、超声时间-酶添加量二次项对多糖提取量呈现显著水平；料液比一次项、超声时间一次项、酶解温度一次项、酶添加量一次项、超声时间-酶解温度二次项、酶解温度-酶添加量二次项呈现极显著水平；料液比-超声时间二次项、料液比-酶解温度二次项不显著。

2.2.3 青龙衣多糖提取最优条件的确定及验证

使用Design Expert 10.0软件对多元二次回归方程求一阶偏导，得到在料液比1∶23.28，超声时间44.04 min，酶解温度47.54℃，纤维素酶添加量1.55%的条件下多糖提取量达到8.70%。结合实际试验操作的可行性，将上述途径修正为料液比1∶23，超声时间44 min，酶解温度48℃，酶添加量1.55%，在修正后的试验条件下进行验证试验，青龙衣多糖的平均提取量为9.43 mg/g，其误差为0.73%，试验值与理论值基本吻合，说明回归方程能较真实地反映各因素对青龙衣多糖提取量的影响。

3 结论

在单因素试验基础上，通过响应面法设计试验，确定最佳提取条件为料液比1∶23，超声时间44 min，酶解温度48℃，酶添加量1.55%。在此条件下青龙衣多糖提取量达到9.94 mg/g。采用超声辅助纤维素酶提取青龙衣多糖的方法具有成本低廉、方法简便易行的优点，为青龙衣多糖大规模产业化提取加工提供一定理论依据和技术参照。