大鼠骨髓间充质干细胞分离方法的改良与比较*

马逸群， 邵丽诗， 万珊杉， 杨扬， 李嘉琦， 王家平△

1昆明医科大学第二附属医院影像科(云南昆明 650500)； 2云南昆钢医院放射科(云南昆明 650500)

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种来自于动物骨髓腔，具有多分化潜能和自我更新能力的细胞，可通过诱导分化为多种组织细胞，包括骨、软骨、肌肉、肌腱、脂肪及其他结缔组织[1-2]。随着生物细胞技术的发展，BMSCs现已被广泛应用于组织工程学。大量研究证明，移植的BMSCs可归巢至受损的组织器官，通过分化机制和旁分泌机制，对急性肾损伤、慢性肾病、缺血再灌注肾损伤和心肌损伤都有较好的治疗效果[3-5]，是组织工程研究领域理想的种子工程细胞。由于BMSCs具有高度黏附塑料培养瓶的特性，建立有效的贴壁细胞分离方法对实验的进展尤为重要。实验室传统的分离方法多为胰蛋白酶消化法[6-8]，该方法对BMSCs的分离效率较低，传代时间较久。2019年9—11月，本研究对胰蛋白酶消化合并细胞刮刮取法的分离培养方法进行探索，改进了传统的分离方法，以期在较短的时间内获得更多数量的BMSCs，为BMSCs进一步研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠9只，体重(200±15)g，由昆明医科大学动物部提供；取材过程符合动物伦理学标准。

1.1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清(FBS)、培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)、青链霉素、胰蛋白酶-0.25%EDTA(美国Gibco公司)；离心管、细胞培养瓶(NEST公司)；细胞刮(Corning公司)；CKX41倒置相差显微镜(日本Olympus 公司)；CO2培养箱(Thermo公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 BMSCs的提取与培养 按照文献所述方法[9]，将9只大鼠经腹腔注射水合氯醛麻醉并脱颈处死，置于75%酒精中浸泡5 min。于超净工作台中取股骨并置于含有PBS的培养皿中，剪断股骨的干骺端，充分暴露骨髓腔；用培养基反复冲洗骨髓腔，直至冲洗液变透亮；分别收集每只大鼠的细胞悬液于15 mL离心管中，2 000 r/min离心30 min，弃上清液，用PBS吹打重悬后再以1 600 r/min离心10 min后去上清，加入含10%FBS与1%青链霉素的完全培养液重悬细胞；将细胞悬液分别接种在9个塑料培养瓶中并置于37℃、5%CO2恒温培养箱中孵育。24 h后首次换液，以后每3 d换液1次。1周后于倒置显微镜下观察BMSCs生长融合至80%～90%时开始传代。

1.2.2 分组与处理 将9瓶BMSCs随机分为3组，A组(n=3)：利用细胞刮直接刮取贴壁生长的BMSCs，收集细胞悬液于15 mL离心管中；B组(n=3)：向培养瓶中加入1 mL胰蛋白酶-0.25%EDTA溶液于室温下消化3 min，镜下观察细胞变圆、间隙变宽时加入3 mL完全培养液终止消化，用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁，收集细胞悬液于15 mL离心管中；C组(n=3)：向培养瓶中加入1 mL胰蛋白酶-0.25%EDTA溶液于室温下消化2 min，加入3 mL完全培养液终止消化，再利用细胞刮刮取贴壁生长的BMSCs，收集细胞悬液于15 mL离心管中。将离心管配平后以1 500 r/min离心10 min并弃上清，PBS清洗3次彻底去除胰蛋白酶-0.25%EDTA溶液，用完全培养液重悬细胞，按1∶3传代后每3 d换液1次，每次换液时去除悬浮生长的细胞，直至各组BMSCs生长融合至80%～90%。

1.3 观察指标 使用3种方法进行传代后，于倒置显微镜下(100×)随机选取5个视野观察原代培养瓶中剩余细胞的数量、传代细胞的生长数目与密度，每天记录每高倍视野细胞数目、各组BMSCs传代后到收获所需的时间。采用ImageJ软件进行细胞计数。

2 结果

2.1 传代后原代培养瓶剩余贴壁细胞的数量 A组与C组贴壁细胞数目较少，镜下多数区域几乎未见BMSCs，分离较为彻底；B组瓶底可见较多贴壁细胞，呈圆形，形态相似，大小均一。见图1。

注：A：A组；B：B组；C：C组

2.2 传代后每高倍视野细胞数目 第1天时C组BMSCs贴壁数目明显多于其余两组(P<0.001)，同时各组培养基中可见少量悬浮细胞。第2天起C组贴壁细胞开始呈现鱼群状分布趋势，其余两组仍呈散在分布。第7天时，C组细胞几乎长满瓶底，BMSCs生长融合达80%～90%，其余两组细胞间隙较大，仍未达到收获标准。见表1。

表1 传代后每天各组培养瓶中BMSCs数量变化 个/视野

2.3 传代后到收获所需时间 C组在传代后第5天便有1瓶BMSCs长满瓶底，其余各瓶第7天时也几乎达到收获标准。A组从传代到收获所用时间为(8.1±0.8)d；B组所用时间为(10.3±0.8)d；C组所用时间为(6.7±0.9)d。C组收获时间明显短于其余两组(P<0.001)。

3 讨论

随着再生医学的发展，干细胞被逐渐应用于细胞生物学工程。作为干细胞家族的主要成员，BMSCs因其多能性和易分离性已被广泛应用于组织修复和再生领域[10]。同时，使用BMSCs避免了类似于胚胎干细胞、羊水干细胞及人脐带间充质干细胞的伦理争议。已有的研究表明，移植入体内的BMSCs可在SDF-1/CXCR4生物轴的趋化作用下归巢至受损组织，通过多种机制对受损组织进行修复[11]，早期的研究证明BMSCs可分化为相应受损组织的细胞，对受损组织进行修复，但分化的细胞数量较少；近期有学者发现间充质干细胞可分泌诸多生长因子与外泌体，提示其旁分泌/内分泌作用可对受损组织发挥保护作用[12-13]；Gharaibeh等[14]认为移植入体内的干细胞的终末分化能力不是其促进受损细胞再生潜能的决定因素，而干细胞的旁分泌作用对组织再生修复的影响更大。有学者利用干细胞条件培养基(conditioned medium，CM)通过体内实验和体外实验对动物受损组织进行干预，但其修复作用目前尚存在争议[15-16]。此外，BMSCs可自体移植，无免疫排斥、致肿瘤性且来源广泛，可从多种组织中分离获取，是较为理想的细胞治疗选择。由于BMSCs在骨髓中含量较低且具有高度贴壁生长的特性，因此如何提取、分离、纯化BMSCs对其传代和生长具有重要的意义。

目前常用的BMSCs提取方法主要有密度梯度离心法、流式细胞仪法、全骨髓培养法等[17-18]，本实验采用全骨髓培养法进行BMSCs的培养和提纯，根据BMSCs在完全培养液中具有贴壁生长的特性，定期换液，去除悬浮细胞，从而达到纯化细胞的目的，获得的BMSCs总体形态均匀，数量较多。在BMSCs传代过程中，实验室常用分离贴壁细胞的方法是消化剂消化法，该方法利用生化原理降解组织细胞之间的蛋白，使组织松散、细胞易分离，常用的消化剂包括具有消化蛋白质作用的胰蛋白酶、胶原酶、分离酶和链霉蛋白酶，以及与Ca2+、Mg2+结合、具有分散作用的乙二胺四乙酸等，经处理的BMSCs在细胞骨架张力的作用下可皱缩成球形，细胞间距扩大，用吸管反复吹打可将多数细胞冲洗下来，该方法在操作时涉及到消化和离心等步骤，使用试剂较多，耗时较长、操作复杂，同时该方法存在较多缺陷，如消化时间不易掌握，消化时间过短细胞不易脱落，传代效率低；消化时间过长可能导致细胞膜的破坏，引起细胞坏死。细胞刮分离细胞法是利用机械外力将贴壁细胞直接从培养瓶底刮除的方法，从实验的结果来看，该方法分离细胞的效率优于胰酶消化法，经处理后的原代培养瓶贴壁细胞明显更少，获得的传代细胞数量更多、生长更快，收获时间更短；该方法在刮取过程中可能导致部分紧密贴壁的细胞破裂，多数细胞不受影响，对细胞总体损伤较小。胰蛋白酶消化合并细胞刮刮取法是先利用胰酶处理细胞，使细胞之间相互分离，细胞与培养瓶之间的黏附作用减弱，此时细胞刮作用于细胞时，贴壁的细胞相对易于脱落，与直接刮取细胞法相比，该方法对细胞的损伤更小，提取效率更高。收获时间指BMSCs从传代后到长满培养瓶底、需再次传代所用的时间，是评价细胞生长速度和存活状态的重要指标。本实验中C组平均用时最短，且与其他两组相比有显著差异，证明胰蛋白酶消化合并细胞刮刮取法对细胞分离效果最好，同时对细胞损伤也最小。

该实验在传代过程中需注意以下几点：(1)使用低糖DMEM培养基并维持其pH值在7.2左右；(2)生长液中胎牛血清浓度控制在10%～20%为宜，浓度过低的血清缺乏生长因子使细胞生长缓慢，而浓度过高又易引起细胞老化；(3)分离前应先使用胰蛋白酶消化1～3 min，消化时间过短细胞与培养瓶黏附作用较强，刮取过程中仍会出现细胞损伤死亡，消化时间过长可能导致细胞膜的破坏，同样引起细胞死亡；(4)使用细胞刮刮取BMSCs时，刀头与培养瓶底角度不宜过大，刮取过程应尽量保持力度均一，并重复刮取3次以上；(5)体外培养的BMSCs增长速度与其数目和密度相关，BMSCs的生长状态及密度是判断其传代时机的重要依据，在镜下观察可见生长活力较好的BMSCs常呈多边形且边缘锐利、透光均匀、大小均一，多个细胞可呈鱼群状或旋涡状分布，同时BMSCs生长融合达80%～90%时为传代的最佳时机。本实验将原代BMSCs培养至8 d时观察到贴壁细胞生长状态良好、数量较多，适宜传代。本实验对BMSCs分离培养的方法进行了改进，提高了BMSCs的传代培养技术的可行性。此方法操作简单、对细胞的损伤较小、能有效缩短收获时间并较快的扩增足量的BMSCs。BMSCs细胞替代治疗方面拥有广阔的应用前景，研究中所用的这种改进分离培养方法，为BMSCs的基础研究和应用奠定一定方法学基础。