奇亚籽蛋白及其活性肽的研究进展

罗文涛,彭彬倩,王姿颐,沈晓芳

(江南大学食品学院,江苏无锡 214122)

奇亚籽(chia seed),唇形科(Lamiaceae)植物芡欧鼠尾草(SalviahispanicaL.)的种子,原产于墨西哥南部和危地马拉北部地区[1],属于美洲地区前哥伦比亚文明饮食的核心组成部分[2]。2014年,奇亚籽被国家卫生和计划生育委员会批准作为新食品原料。奇亚籽营养丰富,不仅富含多不饱和脂肪酸(其中α-亚麻酸含量高达60%)[3]、膳食纤维[4]和高品质的蛋白质[5-6],还含有大量的钙、磷、铁等矿物质[7]以及生育酚[8]、植物甾醇[9]、酚类化合物[4,10-11]等多种抗氧化物质。奇亚籽在提取油脂之后的饼粕通常用来生产一些低附加值的产品(如奇亚籽粉,动物饲料等)[12],然而饼粕中还含有大量的蛋白质(30%以上)[13],故进行蛋白的提取再利用具有重大意义。近些年来,许多研究者报道了奇亚籽蛋白及其活性肽的营养功能性质,包括抗高血压[14-16]、抗氧化[13-15]、抗炎症[13,17]、抗菌[18]、抑制胆固醇合成[18]等。本文综述了奇亚籽蛋白及其活性肽的提取分离,并对其功能性质进行了详细阐述。

1 奇亚籽蛋白的氨基酸组成

因受产地、基因类型、环境等影响,奇亚籽蛋白质的含量在19%～27%不等[19],高于小麦、玉米、水稻、燕麦等传统作物[20]。奇亚籽主要储存蛋白为白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,其中球蛋白(7S和11S)含量最高,约占52%～55%,其分子量约为10～60 kDa[14,21-22]。奇亚籽蛋白的氨基酸含量丰富,其中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等必需氨基酸含量高,约占总氨基酸的35%～46%,其含量与大豆、杏仁类似,高于亚麻籽、花生,这接近于联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)推荐的食物蛋白氨基酸组成模式,并且就氨基酸评分和化学评分而言,绝大部分必需氨基酸优于大豆蛋白,其中评分最高的是甲硫氨酸+半胱氨酸[5,7,21,23]。同时奇亚籽蛋白还富含谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸等非必需氨基酸,其限制性氨基酸为赖氨酸[5]。Sandoval-Oliveros等[21]通过液相色谱-质谱联用鉴定奇亚籽球蛋白中多肽,发现其序列与芝麻蛋白具有同源性,且基因序列覆盖率低。脱脂奇亚籽蛋白的氨基酸组成如表1所示。

表1 脱脂奇亚籽蛋白的氨基酸组成Table 1 Amino acid composition of defatted chia seed protein

2 奇亚籽蛋白的提取与分离

提取蛋白质之前需事先除去奇亚籽中的凝胶与油脂。具体步骤为将奇亚籽浸泡在水中促使凝胶的形成,而后冷冻干燥,紧接着机械分离干燥的奇亚籽凝胶,将不含凝胶的奇亚籽粉碎并通过筛网,最后使用有机溶剂萃取以去除其中的脂肪[14,21,24]。

2.1 奇亚籽蛋白的提取

目前,植物蛋白的提取方法主要包括碱溶酸沉法、酶提取法、有机溶剂提取法、盐溶提取法等[25]。Timilsena等[22,26]采用了碱溶解法和等电点沉淀法制备奇亚籽分离蛋白(chia seed protein isolate,CPI),其产率约为17%,蛋白质含量达90%以上,并比较了喷雾干燥、冷冻干燥和真空干燥三种干燥方法对CPI功能性质的影响,研究发现干燥方法没有改变CPI的化学组成,但CPI的结构和功能性质差异性显著,其中真空干燥CPI的堆积密度和吸油能力最高,而喷雾干燥CPI的溶解度、发泡能力、泡沫稳定性和吸水能力最高,且其表面疏水性最低;Chim-Chi等[13]也报道了类似方法分离奇亚籽浓缩蛋白(chia seed protein concentrate,CPC);Vázquez-Ovando等[27]采取干法分馏制备富含奇亚籽蛋白的组分(chia seed protein-rich fraction,CPRF),CPRF的蛋白质含量较脱脂奇亚籽粉(defatted chia seed flour,DCF)提高了约38%;Coelho等[28]比较了化学法(碱性提取、等电点沉淀)和干法分馏三种提取方法对奇亚籽蛋白理化和功能性质的影响,研究发现干法分馏的CPRF虽然蛋白含量(49.7%)比化学法提取的CPC(>70%)低,但其各种功能性质都优于后者,包括蛋白质的溶解度、吸水性、发泡性、乳化性等。López等[29-30]报道了萃取pH对奇亚籽分离蛋白功能性质和结构特征的影响,pH 10制得的CPI色度L*值更大,表面疏水性、吸油能力更强,其制备的乳液粒径更小,且其有序结构β-折叠含量更高(pH 12制得的CPI导致大量的折叠结构打开,导致无序结构增多),热稳定性好。提取方法会影响蛋白质的性能,可根据不同需求采取相应的方法提取奇亚籽蛋白。

2.2 奇亚籽蛋白的分离纯化

由于蛋白的溶解度不同,其中白蛋白(溶于水),球蛋白(溶于盐溶液),醇溶蛋白(溶于醇溶液),谷蛋白(溶于稀碱),使用Osborne分类方法可对奇亚籽粉中的蛋白质进行分级[31]。Orona-Tamayo等[14]在上述奇亚籽粉中加入去离子水,并将悬浊液混合1 h,而后在4 ℃下以14000×g的速度离心20 min,收集上清液,即为白蛋白级分;将得到的沉淀重新悬浮在0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8),振摇混合物并按上述方法离心,其可溶性蛋白组分即为球蛋白级分;用70 mL异丙醇从得到的沉淀中提取醇溶蛋白,并同上述处理;用0.1 mol/L Na2B4O7·H2O溶液(pH 10)提取最终的提取物,得到谷蛋白级分;最后,将所有级分进行透析,并进行冷冻干燥。Vázquez-Ovando、Grancieri、Sandoval-Oliveros等[6,17,21]也采用了类似的方法对奇亚籽蛋白进行分级。蛋白质的分级纯化有利于奇亚籽蛋白的进一步应用,为其精细加工提供了理论基础。

3 奇亚籽蛋白的功能性质

3.1 溶解性

在功能性质中,蛋白质的溶解度非常重要,它与蛋白的乳化性,发泡性和胶凝特性密切相关[32-33]。蛋白质的溶解度与pH有关,Vázquez-Ovando等[27]报道了CPRF在pH为4时溶解度最低,为11.7%,pH为10时溶解度最高,为60%。Bushway等[34]报道了奇亚籽蛋白在pH为12时具有更高的溶解度。Timilsena等[22]报道了不同干燥方法制得的CPI在不同pH、盐离子强度和温度下的溶解度,与其他蛋白一样,CPI的溶解度在等电点(pH为3.0)时最低,由于强烈的分子间相互作用,蛋白质在等电点附近聚集,导致蛋白质与水的相互作用更弱,因此蛋白质的溶解度更低[35],而当pH高于或低于等电点时,蛋白质分子带有净负电荷或正电荷,这极大地增强了蛋白质与水之间的相互作用,导致溶解度增加;加至1 mol/L NaCl时,其溶解度增加,继续增加浓度至2 mol/L NaCl时,溶解度显著降低,在高盐溶液中,水分子优先与盐结合,使得蛋白质没有足够的水分子进行溶剂化,由盐析作用导致蛋白的聚集与沉淀;CPI在50 ℃下的溶解度相比于20 ℃增加了约38%,当温度低于变性温度时,蛋白质与水作用力的增加而不会诱导蛋白质的折叠结构打开。Coelho等[28]报道了三种蛋白产品的溶解度,DCF>CPRF>CPI。

3.2 热稳定性

变性温度是衡量蛋白质热稳定性的一个指标[36-37]。Olivos-Lugo等[5]利用差式扫描量热法(differential scanning calorimeter,DSC)对奇亚籽蛋白的各个组分进行热分析,球蛋白的变性温度最高,为125 ℃,醇溶蛋白最低,为70.4 ℃。Sandoval-Oliveros等[21]不仅测得球蛋白变性温度为104.7 ℃,醇溶蛋白为85.6 ℃,另一方面,ΔH值代表了蛋白质结构变性所需的能量,白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的值分别为12.6、4.7、2.3和6.2 J/g。不同的提取方法、灰分及蛋白含量导致了不同的变性温度,Coelho等[28]使用干法分馏制得的CPRF的变性温度高达135.4 ℃,其变性温度高于化学法(碱溶解法和等电点沉淀)制得的CPI,而CPRF的变性焓为68.1 J/g,小于另外两种CPI。蛋白的稳定性还受到极性和非极性残基平衡的影响,非极性残基的比例越高,热稳定性越大[38]。López等[30]通过热重分析观察CPI的热解过程,主要分为三个阶段,100 ℃以下,主要是水分的损失;第二阶段质量减轻速度更快,大多数挥发物在此阶段释放,主要是蛋白质的降解,还有小部分碳水化合物的降解,热重的导数曲线显示其主要挥发峰在300 ℃附近;第三阶段为前一步骤固体残余物的缓慢分解,主要残留为灰分和未热解的焦炭。

3.3 乳化能力

蛋白质的乳化活力(emulsifying activity,EA)是指蛋白质将油和水结合在一起形成乳状液的能力,乳化稳定性(emulsifying stability,ES)是指油水乳状液保持稳定的能力。Vázquez-Ovando等[27]报道了奇亚籽蛋白的EA与ES,CPRF的EA在测试pH范围内(2～10)变化不大,为50.5%～56%,ES在pH为6时最小,为63.5%;在碱性条件下大于95%。Coelho等[28]报道了类似的现象,相比于CPI,DCF和CPRF具有更好的EA和ES。López等[29]报道了CPI较高的溶解度和表面疏水性,产生更高的乳化活性,从而形成更小的乳液粒径。

3.4 发泡能力

泡沫的形成与稳定的能力取决于蛋白质的类型、变性程度、钙离子、pH、温度和搅拌方法[39]。发泡能力(foaming capacity,FC)受空气界面吸附速率,柔韧性以及疏水性的影响,而泡沫稳定性(foaming stability,FS)取决于蛋白质的流变性质[5]。Vázquez-Ovando等[27]报道了奇亚籽蛋白的FC和FS,CPRF的FC在测试pH范围内(2～10)变化不大,只有一个略微增加的趋势,其值为22.27%～28.80%,而FS受pH影响巨大,pH为2时(5 min)的FS为<30%,到120 min降低至5%以下,而pH为8或10(5 min)的ES约为80%,到120 min的ES降低至30%左右。Olivos-Lugo等[5]报道了奇亚籽中CPRF和谷蛋白的发泡能力分别为70%和77%。Coelho等[28]报道了CPC具有高发泡能力,然而泡沫稳定性很低。

3.5 保水性和保油性

保水能力(water-holding capacity,WHC)定义为施加外力后水合蛋白质保留的水分[40];而保油能力(oil-holding capacity,OHC)是指通过侧链非极性蛋白与油的结合[41]。Olivos-Lugo等[5]报道了CPI和谷蛋白的WHC分别为4.06和3.09,OHC分别为4.04和6.23,这两个值都优于豇豆(WHC=2.20,OHC=1.10)[40]。Timilsena等[22]也报道了相似的值,WHC为2.1～2.9,而OHC为2.7～3.6。Coelho等[28]报道了类似的值(OHC为2.3～3.7),但由于DCF和CPRF中较高的凝胶含量,导致其WHC明显高于CPI,其疏水位点的暴露有利于与脂质结合。蛋白质纯度的差异以及蛋白质分离物的构象特征导致不同的水结合能力[42]。López等[29]报道了WHC=4.4～6.0,OHC=6.1～7.1,这两个值均高于其他假谷物蛋白分离物的报道[43-44]。

3.6 胶凝特性

CPRF悬浮液具有高黏度(2000～12000 cP),呈现出剪切变稀的性质,与假塑性流体性质相同,CPRF的粘度高于大多数不同来源的粉,浓缩物和分离物,这与其中残留的凝胶有关[27]。Coelho等[28]也报道了CPRF和DCF的胶凝行为,而且碱性溶解法制得的CPI也能形成强凝胶,最低胶凝浓度值越小说明浓缩物形成凝胶能力越强[45]。López等[29]报道了CPI的热诱导凝胶化,在整个凝胶化过程中分析G′(储能模量)和G″(损耗模量)的变化,其中pH 10制得的CPI的凝胶温度为80 ℃,pH 12制得的CPI为62 ℃,这与苋菜和豌豆蛋白分离物(凝胶温度约为70 ℃)[46],藜麦蛋白分离物(凝胶温度64.6～87.36 ℃)类似[47]。

3.7 体外消化

Olivos-Lugo等[5]利用胃蛋白酶在0.1 mol/L HCl溶液中于37 ℃对奇亚籽蛋白消化2 h以测定蛋白的体外消化率,其中DCF的消化率为28.4%,CPI的消化率为49.4%。而Sandoval-Oliveros等[21]使用0.1 mol/L HCl或NaOH调节蛋白质溶液pH至8,而后加入一种复合酶液(胰蛋白酶、糜蛋白酶和肽酶),在37 ℃水浴中搅拌10 min测定奇亚籽蛋白的体外消化率,结果表明DCF的消化率为78.9%,球蛋白的消化率为82.5%。Vázquez-Ovando等[6]报道了类似的方法测定CPRF的消化率为77.53%。

奇亚籽蛋白具有许多优良的功能性质,溶解性好,可以作为新食品原料应用在饮料;保水性好,有利于保护熟食上的水分,保油能力强,蛋白质与油脂的结合能力增强,有利于风味保持,可以改善口感[32],可以应用在烘焙食品和肉制品;乳化性好,可以作为乳化剂应用在奶油、巧克力、人造黄油上;发泡性好,可以应用于食品体系的通气与搅拌,也可以作为发泡剂应用在冰淇淋。

4 奇亚籽蛋白活性肽的制备与生理功能

4.1 奇亚籽蛋白活性肽的制备及分离纯化

制备活性肽常用的方法是酶解法,其关键在于蛋白酶的种类与酶解条件[48]。Segura-Campos等[16]利用碱性蛋白酶和风味蛋白酶分批水解CPRF,水解底物浓度为2 g/100 g,水解温度为50 ℃,首先加入碱性蛋白酶,酶与底物比为0.3 AU/g,调节pH至7,预消化60 min,而后加入风味蛋白酶,酶与底物比为50 L APU/g,调节pH至8,水解90 min,制备的活性肽具有良好的生物活性。Chim-Chi等[13]也采用了类似的方法酶解CPC以制备具有抗氧化活性的活性肽,Coelho等[49]不仅报道对DCF和CPRF的酶解,同时也酶解了CPI来制备活性肽。

生物活性肽常用的分离纯化方法主要包括电泳法、层析法、膜分离技术和盐析法等[50]。Segura-Campos等[16]利用凝胶过滤层析技术制备了5种超滤肽段(ultrafltered peptide fraction,UPF),低分子量的活性肽的生物活性强于高分子量的。Coelho等[49]利用超滤技术分离了三种不同分子量的活性肽,同样地,分子量小的活性肽具有更强的抗氧化活性。

4.2 奇亚籽蛋白活性肽生理活性

4.2.1 血管紧张素转化酶(Angiotensin I-converting enzyme,ACE)抑制活性 ACE是在不同组织中发现的多功能含锌酶[51],ACE通过将血管紧张素I转化为强大的血管收缩剂血管紧张素II并使血管扩张剂缓激肽失活,它通过肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)和激肽释放酶-激肽系统在(kallikrein-kinnin system,KKS)在血压调节中起重要作用[15-16]。ACE抑制主要起降血压作用,但也可能影响免疫防御和神经活动的调节系统[52]。

Segura-Campos等[16]报道了CPRF水解产物的ACE抑制活性为58.5%,低于牦牛酪蛋白水解物(79.5%),但高于苋菜白蛋白和球蛋白水解物(5%～50%)[53-54],而后对水解产物进一步纯化以增加其生物活性,纯化后得到5种UPF,它们的ACE抑制活性增加为53.8%～69.3%,其中>10 kDa级分活性最低,而<1 kDa级分活性最高,<1 kDa的级分中疏水性氨基酸含量为41.68%,而疏水性越强,ACE抑制活性越强,这与牦牛酪蛋白水解产物的结果类似(<6 kDa部分是最有效的,ACE抑制活性为85.4%)[55]。

Segura-Campos等[15]报道了水解时间对奇亚籽蛋白ACE抑制活性的影响,其中150 min的活性最强(IC50=8.86 μg蛋白质/mL,IC50为产生50%的ACE抑制需要的肽浓度,)其次是120 min的20.76 μg蛋白质/mL和90 min的44.01 μg蛋白质/mL,它们的抑制活性强于鹰嘴豆分离蛋白(191 μg蛋白质/mL)和豇豆水解产物(1397.9～2564.7 μg蛋白质/mL)[56-57]。

Orona-Tamayo等[14]报道了奇亚籽白蛋白和球蛋白组分ACE抑制效果好,是ACE肽抑制剂的良好来源,并且还存在疏水性和阴性可电离氨基酸(苏氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸)。Kitts等[58]发现ACE抑制肽通常是只有2～9个氨基酸的短肽,大多是二肽或三肽,并且对消化道内肽酶的作用有抗性,Kim等[59]发现含脯氨酸的肽段一般能抵抗消化酶的降解。作为抗高血压剂的奇亚籽蛋白活性肽在到达其靶位之前不能被消化酶降解而失活,可用于高血压的预防和轻度高血压的初步治疗,然而需要进行一些体外和体内消化实验以确定肽的实际效果。

4.2.2 抗氧化活性 过量自由基引起细胞损伤,触发疾病[60]。由于含有大量的酚类化合物,奇亚籽是一种具有高抗氧化能力的种子[61-62],Chim-Chi等[13]发现DCF中酚类化合物含量更高,含量为1010.98 mg没食子酸/100 g。抗氧化能力不仅与肽的大小有关,而且与其氨基酸组成、序列、结构和疏水特性有关[63-64]。

Segura-Campos等[15]测定了奇亚籽蛋白在不同水解时间下水解产物的抗氧化活性,主要测定2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS+)清除能力,以TEAC(Trolox equivalent antioxidant coefficient)定量计算,水解90 min制备活性肽的TEAC最高(7.31 mmol/L-mg蛋白质),其次是水解120 min和150 min,它们的TEAC分别为4.66和4.49 mmol/L-mg蛋白质。水解时间越长,水解度越高,抗氧化活性越低,因为蛋白长时间水解产生游离氨基酸,活性肽被分解,然而肽是比氨基酸更好的抗氧化剂,因为它们自由基清除能力、金属螯合活性更强,因而造成抗氧化活性降低。为了更加全面地研究奇亚籽蛋白活性肽的抗氧化能力,Chim-Chi等[13]从β-胡萝卜素变色、铁还原抗氧化能力、亚铁离子螯合、铜离子螯合四个方面测定活性肽的抗氧化能力,其中抗氧化剂通过包埋自由基,促进氧化金属螯合,抑制活性氧和还原氢过氧化物[65],研究发现水解60 min制备活性肽的β-胡萝卜素变色能力最强,抗氧化活性指数为86.16%;水解120 min铁还原抗氧化能力最强,为92.26%;水解240 min亚铁离子螯合能力最强,为86.89%;水解60 min铜离子螯合能力最强,55.35%。奇亚籽蛋白水解产物可能起到电子供体和自由基沉降的作用,从而提供抗氧化活性[15]。

为了进一步研究奇亚籽活性肽的抗氧化能力,Orona-Tamayo等[14]通过清除ABTS+和DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基以及亚铁离子螯合能力来表征抗氧化能力,结果表明白蛋白和球蛋白制备活性肽的自由基清除能力强于醇溶蛋白和谷蛋白的活性肽,而醇溶蛋白的活性肽螯合亚铁离子能力最强,奇亚籽活性肽对ABTS+和DPPH自由基的抗氧化活性可能来自于广泛水解,形成了更短的肽,这阻碍其作为电子供体的能力,而亚铁离子催化引发氧化反应的活性自由基,导致脂质氧化和DNA损伤,与金属离子螯合可减缓链反应[66-67]。Coelho等[49]报道了类似的结果,并研究了体外和体内抗氧化能力,包括对肉中脂质氧化的影响,研究发现活性肽能够显著减缓牛肉糜的氧化,而后进行了酿酒酵母存活实验,加入蛋白水解产物使细胞存活率提高了27.0%,细胞存活率的增加表明它的保护能力。

4.2.3 抗菌活性 Coelho等[18]研究了不同水解度活性肽的抗菌活性,观察到了清晰的生长抑制区,其中DCF和CPRF水解产物显示出了对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制,而CPC水解产物只对金黄色葡萄球菌有抑制,对大肠杆菌几乎无抑制作用,而且使用风味蛋白酶和连续使用碱性蛋白酶-风味蛋白酶的产生的水解产物的抗菌效果优于使用单一碱性蛋白酶。革兰氏阳性菌对水解产物的敏感更高与细菌本身的结构有关,其细胞壁只有一层,主要由肽聚糖组成,而革兰氏阴性菌外膜为脂多糖组成,内膜由磷脂组成[68]。Sun等[69]的研究中也报道了相似的抑菌活性,螺旋藻蛋白水解产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有显著抑制作用。

4.2.4 其他生理功能 炎症和氧化应激与心血管疾病的发生直接相关[70]。Grancieri等[17]利用胃蛋白酶和胰酶水解奇亚籽蛋白制备活性肽,研究发现活性肽对超氧自由基、过氧化氢、一氧化氮和DPPH自由基具有较强的清除能力,并且能抑制5-脂氧合酶,环氧合酶-2和诱导型一氧化氮合酶的活性,这阻碍了炎症的发生过程,显示出抗炎症作用。Coelho等[18]报道了奇亚籽蛋白活性肽具有抑制3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的能力,从而抑制胆固醇的合成。

关于奇亚籽蛋白活性肽生理功能的研究,特别是已经鉴定功能的活性肽,不仅拓宽了奇亚籽蛋白的应用,同时为某些疾病(如高血压、动脉粥样硬化等)的预防与治疗提供了新的思路,奇亚籽蛋白活性肽的特定功能应该进一步研究确定。

5 结语

自2014年国家卫计委批准奇亚籽进入我国以来,因其营养功能丰富而受到广泛关注,国内越来越多的人开始了解这款“超级食品”。然而目前大多数研究主要集中在奇亚籽油方面,对提取油脂之后的饼粕关注较少,饼粕中含有大量的优质蛋白,这些蛋白具有许多优良性能,可以提取回收再利用,提高剩余价值,减少资源浪费。不同的提取方式会影响蛋白的功能性质,可以根据需要调整提取条件以获得期望的蛋白。如今植物蛋白制备的生物活性肽备受关注,使用活性肽抵抗慢性疾病和补充营养成分的趋势逐渐增强。但活性肽的分离纯化成本高,产量低,还难以实现工业化生产,其次是活性肽产生生物活性的机理还不明确,体内实验功效尚无太多报道,距离商品化还有许多问题和障碍。制备成本低、活性好、纯度高且具有明确功能的活性肽值得进一步研究。