二羟丙酮羰氨反应体系中烷基吡嗪生成规律的研究

罗泰端,林珮璇,张宏婧,陈继承

(福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002)

美拉德反应又称为羰氨反应,指的是含游离氨基的化合物和还原糖或羰基化合物在常温或加热时发生的聚合、缩合等反应,经过复杂的过程,最终生成棕色甚至是棕黑色的大分子物质类黑精、还原酮、醛和杂环化合物,这些物质是食品色泽和风味的主要来源[1]。羰氨反应是现代食品工业不可或缺的一部分。吡嗪类化合物是羰氨反应的生成物之一,也是重要的风味成分,广泛存在于天然食品及食品加工过程中。

烷基吡嗪(Alkylpyrazine,APZ)是一种以吡嗪为基础的具有不同取代方式的化合物,具有非常低的气味阈值[2],有助于食物形成特殊的风味[3]。不同的APZ具有不同的香气特征[4],在食品中具有重要的感官特性。同时,药理学研究表明吡嗪类化合物还具有预防急性酒精性肝损伤、降血压、降血脂等功效[5-7]。目前所报道的许多吡嗪类化合物反应模型都是在美拉德反应体系中建立的,如肽类组分美拉德反应体系中吡嗪类化合物的生成,葡萄糖-肌酸酐-氨基酸的美拉德反应中可生成十几种吡嗪产物[8-10]。研究发现不同的反应底物、温度等均会影响APZ的形成[11]。

α-羟基羰基化合物(α-hydroxy carbonyl compound,α-HCC)是APZ形成的关键前体物之一,可与铵盐通过羰氨反应经strecker降解和Amadori重排产生APZ。α-HCC的主要物质有三个:3-羟基丁酮(乙偶姻)、二羟基丙酮和羟基乙醛。其中关于乙偶姻的研究已有诸多报道,多用于TMP的生成[12-13]。二羟丙酮是最简单的酮糖,重要的糖代谢中间产物、医药中间体和功能性添加剂[14],可作为抗病毒试剂,也可作用于食物的保鲜[15]。Adams等[16]研究发现,二羟丙酮和2-氧丙醛为底物反应可生成丰富的吡嗪类产物。目前关于美拉德反应体系中生成APZ的研究很多,但多集中于单一吡嗪产物。α-HCC的三个主要物质中只有乙偶姻的相关研究较为完善,另两个物质的研究报道则较少。因此本文以二羟丙酮与铵盐为底物,探究在α-HCC与铵盐的反应体系中,吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、TMP、2-乙基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-5(6)-甲基吡嗪10种烷基吡嗪的生成规律及影响因素。本文进一步丰富了在羰氨反应体系中对新的APZ生成模型的研究,显示了二羟丙酮与铵盐反应生成的吡嗪产物的多样性,且该模型耗时短,操作简单,对温度的要求低,为APZ的生成提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-5(6)-甲基吡嗪,二羟丙酮 均购自上海源叶生物科技有限公司;乙酸铵、氯化铵、硫酸铵、过硫酸铵、柠檬酸氢二铵均 分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;乙腈、甲醇 色谱纯,购自德国默克公司。

高效液相色谱仪 Waters C18色谱柱(4.6×250 mm,5 μm),美国Waters公司;HWS-24型电热恒温水浴锅 吉林省胡玛环保涂料有限公司;pH计 瑞士METTLER TOLEDO有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 铵盐种类对烷基吡嗪的影响 分别将0.77 g乙酸铵、0.53 g氯化铵、1.32 g硫酸铵、2.28 g过硫酸铵、2.26 g柠檬酸氢二铵、0.90 g二羟丙酮溶于10 mL去离子水中,分别吸取铵盐溶液与二羟丙酮溶液0.75 mL混合置于带塞试管中,在25 ℃水浴中反应1.5 h,用0.22 μm孔径的滤头过滤,检测APZ含量。

1.2.2 反应时间对烷基吡嗪的影响

1.2.2.1 不同反应时间的影响 分别将0.53 g氯化铵、0.90 g二羟丙酮溶于10 mL去离子水中,分别吸取铵盐溶液与二羟丙酮溶液0.75 mL于25 ℃室温下混合,用0.22 μm孔径的滤头过滤,检测24 h内(含24 h)APZ含量,每3 h进样一次。

1.2.2.2 反应动力学的建立 零级反应是指反应速率与反应物浓度的零次方成正比(即与反应物浓度无关)的化学反应。即反应级数为零的化学反应。

零级反应的反应产物与反应时间满足:[A]t=[A]0-K0t线性关系

式中,[A]t:反应时间为t时的反应产物;[A]0:反应时间为0时的反应产物;-K0:斜率;t:反应时间。

1.2.3 反应温度对烷基吡嗪的影响 分别将0.53 g氯化铵、0.90 g二羟丙酮溶于10 mL去离子水中,分别吸取铵盐溶液与二羟丙酮溶液0.75 mL混合置于带塞试管中,置于温度为25、35、45、55、65、75、85、95 ℃的水浴中反应1.5 h,用0.22 μm孔径的滤头过滤,检测APZ含量。

1.2.4 反应底物浓度与比例对烷基吡嗪的影响 二羟丙酮与氯化铵的浓度比为1∶1,分别配制浓度为0.5、1.3、2.1、2.9、3.3、4.1、4.5、5.3 mol/L的二羟丙酮氯化铵反应溶液,在95 ℃水浴中反应1.5 h,用0.22 μm孔径的滤头过滤,检测烷基吡嗪含量。固定二羟丙酮浓度为3.7 mol/L,按0.25∶1、0.5∶1、0.75∶1、1∶1、1.25∶1、1.5∶7、1.75∶1、2∶1比例配制氯化铵与二羟丙酮反应溶液。在95 ℃水浴中反应1.5 h,用0.22 μm孔径的滤头过滤,检测APZ含量。

1.2.5 反应pH对烷基吡嗪的影响 用0.1 mol/L盐酸溶液与0.1 mol/L氢氧化钠溶液分别配制pH为3、4、5、6、7、8、9的去离子水溶液10 mL,取0.50 g二羟丙酮溶于1.5 mL不同pH水溶液中,再分别加入0.29 g氯化铵,在95 ℃水浴中反应1.5 h,用0.22 μm孔径的滤头过滤,检测APZ含量。

1.2.6 烷基吡嗪含量的测定 参考陈继承等[17]的方法,略有改进。色谱条件:Waters C18色谱柱(4.6×250 mm,5 μm),进样体积10 μL,流动相A:乙腈,流动相B:含1%甲酸、1%三氟乙酸(V/V)的水溶液,检测波长278 nm,柱温40 ℃,进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure

表2 不同铵盐与二羟丙酮反应生成的APZ种类及含量(占吡嗪总量百分比)Table 2 The types and content of APZ produced by different ammonium salts in reactionwith dihydroxyacetone(accounted for the percentage of total pyrazine)

1.3 数据处理

统计数据采用Excel 2016和SPSS软件(SPSS 25.0 for windows,SPSS Inc,Chicago,IL,USA),采用单因素方差分析(ANOVA)进行“Tukey”差异分析。P<0.05具有统计学意义,所有结果均表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

为了便于结果的讨论,现将文中检测的10种烷基吡嗪进行大致的归类。吡嗪环(Pyr):吡嗪;一甲基吡嗪(MP):2-甲基吡嗪;二甲基吡嗪(DMP):2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪;三甲基吡嗪(TriMP):2,3,5-三甲基吡嗪;四甲基吡嗪(TMP):2,3,5,6-四甲基吡嗪;乙基吡嗪(EP):2-乙基吡嗪;乙基-甲基吡嗪(EP-MP):2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-5(6)甲基吡嗪。

2.1 铵盐对烷基吡嗪的影响

经检测,五种铵盐底物与二羟丙酮反应皆生成了相应种类的APZ。由表2可以看出,在五种铵盐底物中,与二羟丙酮反应生成APZ含量由高到低的排序是氯化铵>硫酸铵>柠檬酸氢二铵>乙酸铵>过硫酸铵,氯化铵所对应的APZ总含量最高,达到(4.59±0.11) mg/L。氯化铵、柠檬酸氢二铵的反应中产生了10种烷基吡嗪,乙酸铵和硫酸铵则包含了8种,过硫酸铵最少,为6种。相比陈诗佳等[18]和赵洪源等[19]通过培育高产乙偶姻菌株以生成四甲基吡嗪的方法,本研究中二羟丙酮与铵盐的反应生成APZ显示了更多可能性,且操作更加简单,耗时短。乙酸铵、氯化铵、硫酸铵、过硫酸铵这四种铵盐的吡嗪产物中,无支链的吡嗪环均是占比最高的,尤其是过硫酸铵,比例高达78.04%。

2.2 反应时间对烷基吡嗪的影响

由表3可知,在氯化铵与二羟丙酮反应体系中,在反应的初级阶段即0～3 h内,反应速率上升较快,APZ生成量快速上升;在3～15 h内,APZ生成量持续增大,但增速减缓,在第15 h达到最高,为(6314.53±75.70) μg/L;在15～24 h,随反应时间的延长,APZ生成量呈上下波动的状态。在化学反应前期,反应速率较快,10种APZ生成量都随着反应时间的增大而增大;在反应的中后期,由于达到化学平衡以及反应底物浓度的降低和逆反应的发生[20]。10种APZ中MP、DMP的含量随着时间延长而下降;Pyr、EP含量则是增长到最高值后,有所下降并逐渐平稳。由图1可知,TriMP和TMP的生成量与时间基本呈线性关系,时间动力学拟合方程均为Y=aX+b形式,遵循零级反应,反应速率与反应浓度无关,生成量始终随着反应时间的增加而增加。TriMP的时间动力学拟合方程为Y=8.7896X+174.33,斜率为8.7896;TMP的时间动力学拟合方程为Y=4.0722X+1192.6,斜率为4.0722,且判定系数(coefficient of determination,R2)均在0.85以上,说明该方程拟合程度较好,在Huang等[21-22]的文章中,证实了在氨基酸-葡萄糖体系中,TriMP与TMP的生成遵循零级反应,此结果与文中相符。

图1 氯化铵与二羟丙酮反应24 hTriMP、TMP生成量的时间动力学Fig.1 Time kinetics of production of TriMP and TMP in 24 hreaction between ammonium chloride and dihydroxyacetone 注:TriMP:2,3,5-三甲基吡嗪;TMP:四甲基吡嗪。

表3 不同反应时间下氯化铵与二羟丙酮反应生成烷基吡嗪含量的变化Table 3 The content of alkyl pyrazine was changed by the reaction ofammonium chloride and dihydroxyacetone at different reaction times

表4 在不同温度下氯化铵与二羟丙酮反应生成烷基吡嗪含量的变化Table 4 The content of alkyl pyrazine was changed by reaction of ammonium chloride and dihydroxyacetone at different temperature

2.3 反应温度对烷基吡嗪的影响

由表4可知,APZ生成量随反应温度的升高而升高,APZ生成量在95 ℃处最高,为(3.41×104±148.20) mg/L,与85 ℃时为(1.52×104±145.60) mg/L存在差异性显著(P<0.05),说明当温度到达一定数值时,氯化铵与二羟丙酮反应APZ生成量能够显著升高。从10种APZ含量随反应温度变化的显著性分析可以看出,相较于另八种APZ,TriMP与TMP在更低的温度即出现显著性差异,分别是55与65 ℃。唐乐攀等[23]研究结果表明:在抗坏血酸-半胱氨酸体系美拉德反应中,生成的吡嗪大部分是甲基吡嗪,在反应温度升高时甲基吡嗪含量随之提升;以糖、氨和氨基酸为底物,探究了反应温度对APZ生成的影响[24],结果显示APZ的收率随着温度的升高而升高。本文结果与此相符,且以二羟丙酮与铵盐作为底物反应生成烷基吡嗪,对温度的要求更低,且生成的APZ的种类更加丰富。

表5 在不同浓度下氯化铵与二羟丙酮反应生成烷基吡嗪含量的变化Table5 The content of alkyl pyrazines was changed by reaction of ammonium chloride and dihydroxyacetone at different concentrations

2.4 反应浓度及比例对烷基吡嗪的影响

由表5可知,随着反应底物浓度的升高,除了EP与E-5(6)-MP含量是呈上升趋势外,其余8种APZ的含量均呈现先上升后下降趋势。其中,包括Pyr、MP、TriMP、TMP以及2,3-DMP含量均是在反应底物浓度3.7 mol/L时最高,2,5-DMP、2,6-DMP与E-3-MP的含量则是在反应底物浓度为4.5 mol/L时最高。APZ生成量在反应底物浓度为3.7 mol/L时最高,为(6375.56±139.17) mg/L。并且,在底物浓度2.1～3.7 mol/L之间,APZ的生成量呈现显著上升,并具有显著差异(P<0.05),最高值比2.1 mol/L处含量增加了339.29%,底物浓度为5.3 mol/L时,与最高值相比APZ生成量下降了30.22%。反应底物浓度对APZ的生成起促进作用,之后含量下降猜测也许是因为底物浓度增加水分活度下降不利于反应进行的原因[25]。

反应底物比例对反应生成APZ含量的影响见表6。除了E-5(6)-MP含量,其他APZ含量的趋势均是先上升后下降。Pyr、TriMP、TMP、2,3-DMP、EP均是在氯化铵与二羟丙酮浓度比例为1∶1时最高;MP在比例为0.75∶1时含量最高;2,6-DMP在比例为1.25∶1时含量最高;2,5-DMP、E-3-MP在比例为1.5∶1时含量最高。总体APZ生成量在底物比例为1∶1时最高。可以看出氯化铵与二羟丙酮反应,二羟丙酮作为碳源,主要是氯化铵转化二羟丙酮生成APZ,当氯化铵比例过低时或过高时,均不利于APZ的生成,由于二羟丙酮的浓度固定为3.7 mol/L,所以当氯化铵比例过高时,APZ生成量降低还有部分原因是因为水分活度下降导致溶解度降低不利于反应的进行。

表6 在不同浓度比例下氯化铵与二羟丙酮反应生成烷基吡嗪含量的变化Table 6 The content of alkyl pyrazines was changed by reaction ofammonium chloride and dihydroxyacetone at different Concentration ratio

表7 在不同pH下氯化铵与二羟丙酮反应生成烷基吡嗪含量的变化Table 7 The content of alkyl pyrazines was changed by reaction of ammonium chloride and dihydroxyacetone at different pH

2.5 不同pH对烷基吡嗪的影响

在二羟丙酮-铵盐体系中,APZ生成量在pH为3时最高,为(5921.33±136.55) mg/L,最低点在pH为9时,为(5417.36±125.95) mg/L,由表7可以看出,pH对10种APZ的影响各不相同,Pyr生成量随着反应pH的增大而减小,其余APZ的生成量皆是随着pH的增大之后上下浮动。其中Pyr、DMP含量的最高点是在pH为3时;E-3-MP含量的最高点在pH为4时;MP、TriMP的最高点在pH为9时;TMP、EP、E-5(6)-MP含量的最高点在pH为8时。可以看出在偏酸性的环境下能促进Pyr、DMP、E-3-MP的生成;在偏碱性的环境下能促进MP、TriMP、TMP、EP、E-5(6)-MP的生成。从表7可以看出随着pH的变化,TriMP、TMP、E-3-MP含量有变化,但是都没有显著性差异(P<0.05),说明pH的变化对这三种APZ无显著影响。在不同的反应体系中pH对吡嗪生成的影响各不相同,余自琳等[26]关于墨鱼酶解物的美拉德反应研究中,反应pH范围在5～10时,TriMP、2,5-DMP、MP含量随着pH增大而升高。而在 Huang等[22]的研究中,pH对TMP形成的影响则与本文相反。可见反应模型体系的不同,反应条件对所生成吡嗪的影响可能呈相反的效果。

3 结论

在二羟丙酮-铵盐体系中,氯化铵与二羟丙酮反应生成的APZ种类与含量最高。在24 h内的反应时间下,APZ生成量在第15 h时最高,为(6314.53±75.70) mg/L,随着反应时间的延长先上升后下降,其中TriMP与TMP的反应动力学遵循零级反应。温度对APZ的生成起促进作用,APZ的生成量随着温度的升高而升高。氯化铵与二羟丙酮反应的最佳浓度为3.7 mol/L,APZ生成量随着反应浓度的升高先上升后下降;反应最佳比例为1∶1,在固定二羟丙酮浓度的情况下,随着氯化铵浓度比例的升高APZ生成量呈现先升后降的趋势;在pH为3时,二羟丙酮与氯化铵反应APZ生成量最高,为(5921.33±136.55) mg/L,随着pH的增大,APZ生成量下降并上下浮动。由于加热方法采用水浴,本文只探讨了在100 ℃以下的烷基吡嗪生成规律,在后期的研究中,将更换加热方法,进行100 ℃以上的研究。本文采用铵盐与二羟丙酮为底物,展示了此模型体系中APZ产物的丰富性,且对于不同的APZ,反应条件的影响也不尽相同,其中的机理还有待进一步的研究。