QuEChERSUPLCMS/MS测定火锅汤料中6种非法添加化学药物

刘 俊,吴爱红,朱 吕,张孝艳,厉晨皓,徐秋生

(平湖市食品药品检测中心,浙江嘉兴 314200)

火锅作为一种传统中国美食,在全国范围内广受欢迎,深受大众喜爱。正因如此,部分商家为了吸引回头客,谋取私利,使得火锅汤料成为非法添加的重灾区。火锅汤料的非法添加主要包括罂粟壳生物碱、工业着色染料和头痛粉三大类[1]。近年来,文献中很多关于火锅汤料中罂粟壳生物碱和工业着色染料的测定方法的报道[2-3],2018年4月国家市场监管总局发布的《食品中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的测定》食品补充检验方法,阐明了火锅汤料中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的定量测定。头痛粉为阿咖酚散的俗称,是一种解热镇痛化学药品。添加到火锅汤料中是为了增味提鲜及防治消费者餐后出现腹泻等身体不适状况。常用的此类解热镇痛类药物包括对乙酰氨基酚(paracetamol)、氯苯那敏(chlorpheniramine maleate)、双氯芬酸钠(diclofenac sodium)、阿司匹林(aspirin)、氨基比林(aminophenazone)和安替比林(antipyrine)等。消费者长期食用含有该类化学药物的食品会产生不良反应或引起急性肝脏、肾脏毒性,严重甚至会造成个体死亡[4-7]。

目前,对乙酰氨基酚、氯苯那敏、双氯芬酸钠、阿司匹林、氨基比林和安替比林检测方法主要有气相色谱法[8]、高效液相色谱法[9-10]、气相色谱-质谱法[11]和液相色谱-质谱法等[12-13]。这些方法多以单一组分进行检测且样品基质相对简单,多为血浆、保健品或凉茶等[14-18]。火锅汤料等高脂肪、高蛋白复杂基质中对乙酰氨基酚、氯苯那敏、双氯芬酸钠、阿司匹林、氨基比林和安替比林检测方法少有报道,国家标准暂未发布权威的检测方法。因此有必要建立一种快速、准确的检测方法对火锅汤料中多种非法添加的化学药物进行筛查。

分散固相萃取技术QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)是一种简单、快捷、准确将目标组分提取与进化的前处理方法[19],已经广泛应用于蔬菜水果和肉类中农药、兽药多残留的检测[20-21]。本实验对火锅汤料进行QuEChERS提取和净化,结合超高效液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)建立火锅汤料中对乙酰氨基酚等6种非法添加化学药物的分析检测,该方法简单、快速、准确。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

6种化学药物标准品:对乙酰氨基酚(纯度99.9%)、马来酸氯苯那敏(纯度99.5%)、双氯芬酸钠(纯度99.2%)、阿司匹林(纯度99.8%)、氨基比林(纯度99.5%)和安替比林(纯度99.9%) 均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇、乙腈 色谱纯,美国赛默飞世尔公司;无水硫酸镁、乙酸钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基硅烷(C18)、石墨化碳黑(GCB)、中性氧化铝和佛罗里硅土(Florisil) 深圳逗点生物;超纯水 实验室制备;0.22 μm有机微孔滤膜 天津美瑞泰克科技有限公司;30批次火锅汤料样品 平湖市8个乡镇街道(当湖街道、钟埭街道、新仓镇各5批次,曹桥街道、独山港镇、新埭镇、广陈镇、林埭镇各3批次)。

Waters Xevo TQ-S高效液相色谱串联质谱仪 美国沃特世公司;高速均质器、涡旋振荡器 德国IKA公司;H1850R高速离心机 湖南湘仪;MS204S电子天平 METTLER TOLEDO(上海)有限公司;Milli-Q Advatantage A10纯水仪系统 法国密理博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 准确称取对乙酰氨基酚、氯苯那敏、双氯芬酸钠、阿司匹林、氨基比林、安替比林6种化学药物标准物质各5.0 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成浓度为500 μg/mL的标准储备液,4 ℃避光储存。分别吸取0.5 mL对乙酰氨基酚、氯苯那敏、双氯芬酸钠、氨基比林、安替比林标准储备液和5.0 mL阿司匹林标准储备液至50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成5.0 μg/mL的混合标准中间液(阿司匹林浓度为50.0 μg/mL)。再用流动相逐级稀释至1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL的混合标准工作溶液(阿司匹林浓度为10.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1000.0、2000.0 ng/mL)。

1.2.2 色谱条件 色谱柱为Waters C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),流动相A:乙腈;流动相B:0.1%甲酸水;流速:0.5 mL/min;进样量:1 μL;柱温:40 ℃。梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序Table 1 HPLC gradient elution program

1.2.3 质谱条件 电喷雾离子源,正离子和负离子扫描(ESI+/ESI-);多反应监测(MRM);离子源温度:150 ℃;脱溶剂温度:450 ℃;脱溶剂氮气流速:1000 L/h;毛细管电压:3 kV。在电喷雾模式下分别对0.5 mg/L、50.0 μg/mL的标准溶液进行全扫描,通过优化离子源、离子管温度和辅助气流量等参数使母离子响应达到最优值,并优化得到每个化学药物的母离子和子离子最佳锥孔电压和碰撞能量,以多反应监测模式进行扫描,选择离子信号前两位分别作为定性或定量离子。具体质谱参数见表2。

表2 6种化学药物的质谱检测参数Table 2 Parameters for mass spectrometric analysis of the 6 chemical drugs

1.2.4 样品前处理 准确称取2.00 g火锅汤料样品于50 mL离心管中,加入2.5 mL水,涡旋均匀试样,加入10 mL 0.1%甲酸-乙腈溶液,涡旋2 min,超声提取10 min。加入3 g无水硫酸镁和1.5 g乙酸钠,涡旋2 min,5000 r/min离心5 min。将上述上清液移取1.0 mL于装有150 mg MgSO4、100 mg PSA、100 mg C18和50 mg GCB的离心管中,涡旋混合1 min,8000 r/min离心5 min,上清液过0.22 μm有机滤膜后上机测定。

1.3 数据处理

实验数据采用Waters Xevo TQ-S高效液相色谱串联质谱仪Masslynx软件分析处理,坐标图标采用Excel软件统计分析,质谱图采用Photoshop软件处理。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件优化

2.1.1 提取溶剂的选择 甲醇和乙腈都是化学药物检测中常用的提取溶剂,但实验过程中用甲醇提取时,加入盐后无法与水相分层,而乙腈加盐后能较好分层且在下一步净化时不需要进行转换溶剂,可简化检测步骤。另外,在化学药物提取时加入适量的酸既能够防止部分药物在碱性条件下发生降解又能更好地去除杂质[22],本实验比较了乙腈和0.1%甲酸-乙腈两种提取溶剂的效果,如图1所示,用0.1%甲酸-乙腈作为提取溶剂时,对乙酰氨基酚、氨基比林和安替比林的回收率明显提高。因此本实验采用0.1%甲酸-乙腈体系进行提取。

图1 不同提取溶剂对6种化学药物质提取效果Fig.1 Extraction efficiencies of 6 chemicaldrugs with different solutions注:A为0.1%甲酸乙腈,B为乙腈。

2.1.2 净化吸附剂的优化 乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基硅烷(C18)、石墨化碳黑(GCB)、中性氧化铝和佛罗里硅土(Florisil)等是QuEChERS方法中常用的净化吸附剂。为考察不同净化剂对6种化学药物的吸附效果,移取1.0 mL浓度为50 ng/mL(阿司匹林500 ng/mL)混合标准溶液分别加入装有100 mg PSA、C18、GCB、中性氧化铝和Florisil离心管中,涡旋1 min,8000 r/min离心5 min,上清液过滤后上机测定。由图2可见,PSA、C18和GCB 3种净化吸附剂对6种化学药物的吸附性不大,均有较好的回收率。而中性氧化铝和佛罗里硅土除了对氨基比林和安替比林吸附性不大外,对对乙酰氨基酚、氯苯那敏、双氯芬酸钠和阿司匹林均具有较强的吸附性,因此,选择PSA、C18和GCB 3种净化吸附剂进行后续的实验。

图2 不同净化剂对6种化学药物质回收率影响Fig.2 Effects of different sorbents on therecoveries of the 6 chemical drugs

净化吸附剂的使用量对待测物回收率也会有较大影响,因此本实验称取2.0 g已知空白火锅汤料样品,加入100 μL混合标准中间液使检测终浓度为50 ng/mL(阿司匹林500 ng/mL),然后按照1.2.4方法进行前处理。移取1.0 mL前处理上清分别加入装有不同质量 PSA、C18和GCB离心管中,涡旋混合1 min,8000 r/min离心5 min,上清液过滤后上机测定。结果如图3～图5所示,分别用质量为100 mg的PSA和C18作为净化吸附剂时,6种化学药物的回收率均大于80%;用GBC作为净化吸附剂时最佳用量为50 mg,加大用量会降低6种化学药物的回收率。因此,本方法最终采用100 mg PSA、100 mg C18和50 mg GCB的组合方案进行净化。

图3 PSA加入量对6种化学药物质回收率影响Fig.3 Effects of PSA dosage on therecoveries of the 6 chemical drugs

图4 C18加入量对6种化学药物质回收率影响Fig.4 Effects of C18 dosage on therecoveries of the 6 chemical drugs

图5 GCB加入量对6种化学药物质回收率影响Fig.5 Effects of GCB dosage on therecoveries of the 6 chemical drugs

2.2 色谱条件优化

本实验分别采用了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水和乙腈-甲酸铵水5种流动相体系。通过对分离效果的综合评价,采用甲酸水-乙腈作为流动相时,6种化学药物的响应值高,分离度、峰形好,6种化学药物标准溶液的质谱图见图6。为进一步确定流动相中最适的甲酸浓度,本实验研究了50 ng/mL(阿司匹林500 ng/mL)混合标准溶液在甲酸体积分数在0.01%～0.5%之间时各组分响应值的变化情况,具体结果见图7,纵坐标为甲酸体积分数下的响应值与最大响应值的比值。结果表明,甲酸体积分数在0.01%～0.1%之间时,大多数组分响应值随着甲酸体积分数的增加而增强,甲酸体积分数超过0.1%后,6种化学药物响应值均有所降低。本实验采用0.1%甲酸水-乙腈作为流动相。

图6 6种化学药物质谱图Fig.6 Mass chromatogram of the 6 chemical drugs

图7 流动相中甲酸浓度对6种化学药物响应值的影响Fig.7 Effects of formic acid solubility on the6 chemical drugs value in mobile phase

2.3 标准曲线和检出限

在1.2.2和1.2.3中确定的色谱条件和质谱条件下,取混合标准工作液用流动相配制1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL(阿司匹林为10.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1000.0、2000.0 ng/mL)系列浓度的标准溶液上机测定,以各化学药物的质量浓度(X)为横坐标,定量离子的响应值峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线,得到各化学药物的线性方程。如表3所示,6种化学药物的线性决定系数均大于0.99,表明各组分在1.0～200.0 ng/mL(阿司匹林10.0～2000.0 ng/mL)浓度范围内均具有良好线性关系。在空白的火锅汤料样品中添加适量浓度的混合标准溶液,按照1.2.4进行样品前处理后质谱分析,以3倍信噪比(S/N)计算仪器检出限(LOD),结果见表3。

表3 6种化学药物的线性方程、决定系数和检出限Table 3 Standard curve,linear correlation and limits of detection of the 6 chemical drugs

2.4 加标回收率和精密度

表4 6种化学药物的平均回收率和精密度(n=6)Table 4 Average recoveries and precisions(RSDs)of the 6 chemical drugs(n=6)

称取2.00 g均质好的火锅汤料空白样品若干份,分别添加5.0、50.0、500.0 μg/kg(阿司匹林为50.0、500.0、5000.0 μg/kg)3个梯度水平的混合标准溶液,样品前处理后进行质谱分析,平行测定6次,计算回收率和精密度。如表4所示,各化学药物的回收率介于72.1%～114.8%,精密度(RSD)为0.81%～14.6%,表明本检测方法准确度好和精密度高,可满足实验室日常分析检测需求。

2.5 实际样品的测定

采用本研究建立的检测方法分别对本市经营餐饮单位的30个火锅汤料进行6种非法添加化学药物残留量的检测,结果显示,在所检的30个批次的样品中有1个批次检出对乙酰氨基酚和阿司匹林,后经执法部门跟进调查,该餐饮店承认其在火锅汤料中添加了含有对乙酰氨基酚、阿司匹林和咖啡因成分的阿咖酚散(俗称头痛粉)。

3 结论

本实验将QuEChERS前处理方法结合超高效液相色谱-串联质谱技术应用于火锅汤料中6种非法添加化学药物对乙酰氨基酚、氯苯那敏、双氯芬酸钠、阿司匹林、氨基比林和安替比林的检测,通过对QuEChERS前处理方法和色谱、质谱条件的优化,建立了定性、定量测定火锅汤料中6种非法添加化学药物残留量的检测方法。该方法前处理操作简便,对火锅汤料基质净化效果好,在1.0～200 ng/mL(阿司匹林10.0～2000 ng/mL)的质量浓度范围内,6种非法添加化学药物的线性决定系数均大于0.99,该方法的检出限在0.05～1.0 μg/kg之间,加标回收率为72.1%～114.8%,相对标准偏差为0.81%～14.6%。该方法可用于火锅汤料中非法添加化学药物的快速筛查,为打击火锅汤料中非法添加行为提供有力依据,保证消费者的合法利益。