三种L苏氨酸的测定方法比较
2020-08-17李泽宇车方怡刘水永恒洒荣波张显忠史仁玖
李泽宇,高 利,车方怡,刘水永恒,洒荣波,张显忠,史仁玖
(山东第一医科大学(山东省医学科学院)生命科学学院,山东泰安 271016)
L-苏氨酸(L-Threonine,Thr),分子式C4H9NO3,相对分子量119.12,白色结晶或结晶粉末,是人体的必需氨基酸之一[1-2]。L-苏氨酸作为八种必需氨基酸之一,广泛地应用在食品[3-4]、饲料[5]、医药[6]、化妆品[3]和保健品[7-9]等多个领域。L-苏氨酸的生产方法主要有发酵法、蛋白质水解法和化学合成法3种。微生物发酵法生产苏氨酸,因其工艺简单,成本低廉等优点已成为目前主流方法[10]。
目前,L-苏氨酸的测定方法主要有氨基酸分析仪法、纸层析法[11-13]、薄层层析法[14-15]、高效液相法[16-18]、荷移比色法[19]等。这些方法分析的原理,分析所需时间、成本、精确度及优缺点都有所不同。氨基酸分析仪法检测效果最好,可分离的氨基酸种类最多,通常作为氨基酸检测的标准。然而氨基酸分析仪只能用来检测氨基酸,且使用的试剂和色谱柱价格昂贵,普通实验室不易拥有。纸层析法分离种类较少的氨基酸效果较好,成本低,一般实验室均可进行,但在分离多种氨基酸和极性相近的氨基酸效果较差。薄层层析法同纸层析法类似,适合分离种类较少的氨基酸,成本低,在分离多种氨基酸和极性相近的氨基酸效果较差[11],与纸层析法相互补可以低成本分离部分常用氨基酸。高效液相法检测效果好,虽检测精度和可分离的氨基酸种类不及与氨基酸分析仪但已满足绝大部分精密实验的需求。价格相对于氨基酸分析仪低很多,并可以测量其他种类的物质,一机多用。缺点是衍生试剂对人体有害,需要注意操作,色谱柱寿命较短,需要经常更换色谱柱。荷移比色法分离效果较好[19],但该方法报道的文献与研究较少,优缺点与层析法类似,故本实验未选取。
针对以上方法的优缺点,本研究选择了纸层析法、薄层层析法、高效液相PITC柱前衍生法进行研究比较。以上三种方法广泛应用并具有明确的代表性。纸层析法和薄层层析法成本低廉,对实验室要求低,一般实验室均可进行,非常适合菌种的初步选育。高效液相法精确快速,成本相对于氨基酸分析仪较低,且高校液相色谱仪用途多样,可用于测定分析多种物质。本文选取的层析滤纸、薄层层析板均为国产,价格较低。本文的高效液相法选择了PITC(异硫氰酸苯酯)柱前衍生法,PITC法相对于其他柱前衍生法样品保存时间长,价格较低,可使用氨基酸分析柱或普通C18柱测定,色谱柱也选择了价格较为便宜的色谱柱。在以往的研究中,将方法数据进行对比的较少。本研究将这三种有代表性的检测方法进行方法学的评价,通过对10份发酵液进行L-苏氨酸含量检测与数据分析,归纳对比了不同方法之间的相关性、应用特点和不足,为L-苏氨酸含量的定性和定量分析以及拓展延伸至其它氨基酸提供技术信息和科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
不同的氨基酸发酵液10份 实验室自制(某基因工程菌株E.coli,中药生物技术实验室保存);PITC、三乙胺、无水乙酸钠、水合茚三酮和L-苏氨酸标准品 索莱宝科技有限公司;正己烷、甲醇、乙腈和丙酮 天津永大有限公司;硫酸铜、正丁醇、冰乙酸和乙醇 天津凯通化学试剂有限公司;硅胶层析板 烟台江友有限公司;新华三号层析滤纸 广州紫宸化玻仪器;除甲醇乙腈为色谱纯外，其他试剂均为分析纯。
高效液相色谱仪 美国安捷伦公司,由G1311B高压四元梯度泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G1315D二极管阵列检测器及安捷伦色谱工作站组成;SMA色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm) 天津普祥科技有限公司;V1100D紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 发酵液样品的制备 取100 μL 1.1中所述菌株的甘油管保存液接入100 mL LB培养基,培养至OD值0.6～0.8,以6%接种量接入摇瓶发酵培养基。蔗糖含量分别为30和45 g/L,其他成分为硫酸铵10 g/L,碳酸钙35 g/L,磷酸二氢钾2 g/L,硫酸镁2 g/L,卡那霉素50 mg/L,甜菜碱1.5 g/L,一水硫酸锰20 mg/L,七水硫酸亚铁20 mg/L。110 ℃,10 min灭菌,初始pH6.8～7.0,37 ℃,200 r/min培养。以添加30 g/L蔗糖培养30、34、38、42和46 h作为样品4、5、2、3和1。以添加45 g/L蔗糖培养48、52、56、60和64 h作为样品6、7、10、8和9。
1.2.2 高效液相法(PITC柱前衍生)
1.2.2.1 溶液配制 PITC乙腈溶液(0.1 mol/L):取0.3 mL PITC置于25 mL容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀,4 ℃保存。三乙胺乙腈溶液(0.1 mol/L)取1.3 mL三乙胺置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀,4 ℃保存。
流动相A:80%乙腈溶液(800 mL乙腈加200 mL超纯水),超声脱气。流动相B:97∶3 (V/V)乙酸钠乙腈溶液(15.2 g无水乙酸钠加超纯水1850 mL溶解,冰醋酸调pH至6.5,加乙腈140 mL),超声脱气。
标准品溶液:精确称取1.0 mg L-苏氨酸标准品,加0.1 mol/L盐酸溶解并定容至2 mL,配制成50 g/L L-苏氨酸母液。通过逐级稀释,配制为0.0625、0.125、0.25、0.5、1 g/L的系列溶液。
1.2.2.2 样品配制 取1 mL发酵液,12000 r/min离心2 min,用超纯水稀释50倍,备用。
1.2.2.3 标准品样品衍生处理 取L-苏氨酸标准品,稀释后的发酵液各200 μL,加入PITC乙腈溶液,三乙胺乙腈溶液各100 μL,混匀,室温放置1 h,加入正己烷400 μL,充分振摇混匀,放置15 min,取下层溶液(不要吸入上层正己烷溶液),重复2次,12000 r/min离心5 min,0.45 μm滤膜过滤。
1.2.2.4 色谱条件 流动相:A为乙酸钠乙腈93∶7 (V/V)溶液,流动相B为80%乙腈;梯度洗脱程序如表1;流速:1 mL/min;柱温度:40 ℃;二极管阵列检测波长:254 nm;进样量:5 μL[17-18]。
表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure
1.2.2.5 标准曲线制作 将0.0625、0.125、0.25、0.5、1 g/L衍生处理后的L-苏氨酸标准溶液按上述HPLC色谱条件进行分析,以标准品浓度X(g/L)为横坐标,峰面积Y为纵坐标,绘制标准曲线。
1.2.2.6 含量计算 每样品重复5次取平均值,以样品分析的色谱峰面积和标准曲线计算出浓度(g/L),乘以稀释倍数即为含量(g/L)。
1.2.3 纸层析法
1.2.3.1 溶液配制 显色液:0.5%茚三酮溶液(0.5 g茚三酮用正丁醇定容至100 mL充分溶解)。展开层析显色液:正丁醇∶显色液∶冰乙酸∶水=10∶2∶3∶5 (V/V)。洗脱液:0.1% CuSO4∶75%乙醇=2∶38 (V/V)。
表2 L-苏氨酸不同含量测定方法间的比较Table 2 Comparison of different methods for determination of L-threonine
标准品配制:精确称取1.0 mg L-苏氨酸标准品,加超纯水溶解并定容至2 mL,配制成50 g/L L-苏氨酸母液,通过逐级稀释,配制为1、2、3、4、5 g/L的系列溶液。
样品配制:取1 mL发酵液,12000 r/min离心2 min,用超纯水稀释10倍,备用。
1.2.3.2 分析方法 将新华3号层析滤纸裁剪至长20 cm,宽10 cm。距离底端2 cm用铅笔划一条线,在线上间隔2 cm使用微量移液枪点样,每次2.5 μL,点样后使用吹风机吹干,连续点样2次。加入约20 mL展开层析液,于层析缸内平衡1 h后放下滤纸,使用大头针固定于层析缸。层析1.5 h,放入烘箱105 ℃干燥显色10 min,剪下显色斑点(每个样品剪下的面积要相同)。每个显色斑点分别置于独立试管中,加洗脱液6 mL,超声40 ℃洗脱30 min,立即使用分光光度计检测510 nm下吸光度。每个样品(标准品)重复5次[12,15]。
1.2.3.3 标准曲线制作 将1、2、3、4、5 g/L的L-苏氨酸标准溶液按上述方法进行分析,以标准品浓度X(g/L)为横坐标,吸光度Y为纵坐标,绘制标准曲线。
1.2.3.4 L-苏氨酸含量计算 每个样品数据取平均值。以样品分析的吸光度和标准曲线计算出浓度(g/L),乘以稀释倍数即为含量(g/L)。
1.2.4 薄层层析法
1.2.4.1 溶液配制 同纸层析法。
1.2.4.2 分析方法 将薄层层析板切割至长16 cm,宽10 cm。距离底端2 cm用铅笔划一条线,在线上间隔2 cm使用微量移液枪点样,每次2.5 μL,点样后使用吹风机吹干,连续点样2次。于层析缸内层析1.5 h后放入烘箱105 ℃干燥显色10 min,刮下显色斑点(每个样品刮下的显色粉末要大致相同)。每个样品的显色粉末分别加入独立试管中,加洗脱液6 mL,40 ℃振动洗脱30 min,静置2 min,立即使用分光光度计检测510 nm下吸光度。每个样品(标准品)重复5次[14-15]。
1.2.4.3 标准曲线制作 同纸层析法。
1.2.4.4 含量计算 同纸层析法。
1.2.5 方法稳定性实验
1.2.5.1 纸层析法条件稳定性 将全新配制的1 g/L L-苏氨酸标准溶液显色斑点显色后置于40 ℃培养箱0～60 min,按照1.2.3后续步骤测定不同放置时间的吸光度。将全新配制的1 g/L L-苏氨酸标准溶液显色斑点显色后置于40 ℃培养箱30 min,按照1.2.3后续步骤测定505～515 nm波长的吸光度。
1.2.5.2 薄层层析法条件稳定性 将全新配制的1 g/L L-苏氨酸标准溶液显色斑点显色后置于40 ℃培养箱0～60 min,按照1.2.3后续步骤测定不同放置时间的吸光度。将全新配制的1 g/L L-苏氨酸标准溶液显色斑点显色后置于40 ℃培养箱30 min,按照1.2.4后续步骤测定505～515 nm波长的吸光度。
1.2.5.3 液相PITC衍生法条件稳定性 将全新配制的1 g/L L-苏氨酸衍生后的标准溶液于4 ℃下放置0～7 d,测定其峰面积。
1.3 数据处理
使用Microsoft Excel等专业软件来处理数据。
2 结果与分析
2.1 三种分析方法的比较
2.1.1 回归方程与线性相关系数 采用3种L-苏氨酸定量方法,配制L-苏氨酸标准溶液进行分析,根据测定结果制成各方法的标准曲线,回归方程见表2。由表2可知,几种方法在有效范围内L-苏氨酸响应值(Y)与样品的质量浓度(X)间有良好的线性关系,其中纸层析法和薄层层析法的决定系数在0.99以上,液相PITC柱前衍生法的决定系数在0.999以上。标准品、样品纸层析、薄层层析、液相PITC三种方法测定的结果见图1～图6。
图1 纸层析法标准品层析图Fig.1 The standard productchromatogram of paper chromatography注:1～5分别为5、4、3、2、1 g/L L-苏氨酸标准品;图2同。
图2 薄层层析法标准品层析图Fig.2 The standard product chromatogram of TLC
图3 PITC法标准品色谱图Fig.3 The standard product chromatogram of PITC method
图4 纸层析法样品层析图Fig.4 The sample productchromatogram of paper chromatography注:1～5分别为样品1～5;图5同。
图5 薄层层析法样品图Fig.5 The sample product chromatogram of TLC
图6 PITC法测定样品的色谱图Fig.6 The sample product chromatogram of PITC method
2.1.2 灵敏度 由表2可知,液相PITC柱前衍生法的检出限最低,为1.2 μg/L,纸层析法其次,为5 μg/L,薄层层析法最高,为7 μg/L。因此,在灵敏度方面,液相PITC柱前衍生法>纸层析法>薄层层析法。
2.1.3 精密度 1 g/L标准品重复测定(n=5),考察方法的精密度,由表2中的结果可见，液相PITC衍生法的精密度最高,为0.3%。纸层析和薄层层析法的精密度相近,分别为4.1%和3.4%。
2.2 各方法条件稳定性实验
2.2.1 纸层析法和薄层层析法条件稳定性优化结果 结果如图7、图8和表3。由表3可知,在不同波长条件下,纸层析法的P>0.05,无显著性差异,薄层层析法0.01
图7 1 g/L L-苏氨酸标准品在不同波长下的吸光度Fig.7 Absorbance of 1 g/L L-threoninestandard at different wavelengths
图8 1 g/L L-苏氨酸标准品在不同放置时间下的吸光度Fig.8 Absorbance of 1 g/L L-threoninestandard at different placement times
2.2.2 液相PITC衍生法条件稳定性优化 结果如图9和表4。在图9中可以看出,在3 d之后峰面积下降明显加快。由表4可知0～3 d的P>0.05,无显著性差异;4～7 d的P<0.01,有极显著性差异。因此在衍生之后应在3 d之内测定结果较好。
表3 纸层析法和薄层层析法条件稳定性优化结果Table 3 Optimization results of paper chromatography and thin layer chromatography for conditional stability
图9 1 g/L衍生后L-苏氨酸标准溶液在不同放置天数下的峰面积Fig.9 Peak area of L-threonine standard solutionafter 1 g/L derivatization under different days of placement
表4 液相PITC衍生法条件稳定性优化结果Table 4 Optimization results of PITC derivative methodfor liquid phase conditional stability
2.2.3 不同方法测定10份样品的L-苏氨酸含量的结果及分析 不同方法测定10份样品的结果见表5。由表6可知,在每组数据的方差分析中,纸层析和薄层层析法方差较大,PITC法方差较小,说明PITC法的精确度最高,纸层析法和薄层层析法的精度次之。
2.3 不同方法的样品加标回收率
准确称取质量为0.2、0.6、1.2 g的L-苏氨酸标准品,加入到前面检测含量最低和最高的两组样品(第4组和第9组样品)中,测定三种方法的平均回收率,如表7所示,测得三种方法的平均回收率分别为95.60%、95.10%和99.30%。
表5 3种L-苏氨酸测定方法对样品的检测结果(n=5)Table 5 Test results of three L-threonine determination methods on actual samples(n=5)
续表
表6 L-苏氨酸含量测定结果Table 6 Determination results of L-threonine
表7 不同方法的样品加标回收率Table 7 Recovery rate of spiked samples by different methods
3 结论与讨论
氨基酸检测的方法多种多样,不同的方法的精度、成本、时间都有所区别。根据不同的检测需求与实验室条件,可选择不同的检测方法。在所选择的三种方法中,纸层析法成本最低,一般的实验室均可进行,本实验所使用的层析滤纸也选择了成本较低的国产滤纸。纸层析法在测定纯度好的L-苏氨酸标准品时,线性、RSD和回收率均排在第三位,在测定混合样品时回收率排在第二位,说明纸层析法在成分较为复杂的样品时优于薄层层析法。在纸层析法实验中,将显色剂与展开剂合一,这样做不仅减少了显色后的花板现象,便于观察结果,也减少了误差和层析时间。展开剂和层析液合一后的层析时间可以缩短为90 min,节省了操作时间,同时展开剂和层析液合一也大大方便了操作。在层析液选取方面,比较了不同层析比例,最终选取了实验所用比例。在条件优化方面,选定了510 nm显色波长和尽快测定。该方法的优点是成本和对实验室条件要求低。缺点是分离氨基酸种类多或者极性相近的氨基酸混合溶液的效果不好。在后续实验中,尝试使用该方法分离多种氨基酸混合标准溶液,效果较差。并结合部分文献分离容易分开的氨基酸种类的混合溶液,虽取得了一定成功,但分离度较差,各氨基酸均有拖尾[20-21]。因此,在使用纸层析法时,对于不同组分的混合溶液,应选取不同的展开剂和条件。
薄层层析法相比于纸层析法,在检测纯度好的L-苏氨酸标准品时,线性、RSD和回收率均好于纸层析法。然而在测定混合样品时,发现其不如纸层析法,原因可能与硅胶的吸附有关,且本实验所使用的层析板为成本较低的国产层析板。在日后的实验中,考虑采用较好的薄层板进行实验。同理,纸层析法也可采用高质量的层析纸进行。考虑到好的薄层板和层析纸价格较贵,不符合低成本测定L-苏氨酸含量的特点,故本实验没有进行比较。在薄层层析法实验中,也将显色剂和展开剂合一,取得了和纸层析法优化后相近效果。在层析液选取方面,比较了不同的层析比例,发现纸层析法所用比例和水∶乙醇∶冰醋酸1∶6∶0.5 (V/V/V)[14]效果接近,为了实验和后续优化条件的方便,故选取同纸层析法一样的层析液。在条件优化方面,显色波长和检测时间与纸层析法接近,故选取510 nm和尽快测定。该方法在洗脱后需要静置一定时间,以便部分由于震荡浮起的硅胶粉末沉降。该方法的主要优点是成本低和对实验室要求低,与纸层析法互补可低成本检测很多氨基酸。缺点和纸层析法类似,分离氨基酸种类多或者极性相近的氨基酸混合溶液的效果不好。在后续实验中同样尝试使用该方法分离多种氨基酸混合标准溶液及结合文献分离部分容易分开的氨基酸种类的混合溶液,结果与纸层析法相似,但容易分开的氨基酸种类不相同[22]。因此,纸层析法和薄层层析法可以互补来低成本测定部分种类的氨基酸混合溶液。目前,一些研究者使用纳米显色剂来对薄层层析法进行进行快速薄层直读显色分析[23],这种方法相比于传统方法快速高效,值得在以后的实验中深入研究。
高效液相PITC衍生法相比于其他两种方法最精确,当然成本也最高,不过相比于功能单一的氨基酸测定仪,高效液相色谱仪可以一机多用。在预实验中,也进行了其他衍生方法的实验[24-27],考虑到成本和样品保存,最终选择了PITC作为衍生剂。在色谱条件方面,参考了色谱柱自带说明书和文献,比对了不同的条件,最终选择了该色谱方法。在实际操作中,应根据自身色谱柱选择合适的分析方法。使用的色谱柱虽然是氨基酸分析柱,但价格较低,约3000元左右,该价格与普通C18色谱柱相当。该方法优点是所用的试剂相比于其他衍生试剂,保存时间长,价格较低,在分离多种按氨基酸混合溶液时分离度较好。缺点是该方法不能用于在线衍生,以及残留在分析柱中的痕量衍生剂会缩短分析柱寿命[24]。在后续实验中,使用该方法分离氨基酸混合标准溶液,效果较好。但在参考其他分离方法的基础上[28-30],分离种类很多的混合标准溶液时效果远不如氨基酸分析仪。因此,在分离种类很多,一般大于17种常用氨基酸种类的混合溶液时,建议使用氨基酸分析仪进行检测。
在误差减少方面,纸层析法和薄层层析法后期采用了去掉极值取平均值的方法来减少误差,同时,在这两种实验操作过程中,应注意以下几点,可有效减少误差:操作过程中全程戴干净手套;所有实验接触品都应用超纯水水清洗干净(水可有效溶解L-苏氨酸及大部分其他氨基酸);点样尺寸不宜过大;层析液现用现配;每次测定完的仪器都应充分冲洗;薄层层析板和层析滤纸要保持干净,鉴于目前很多运输过程中的污染,建议使用中间的几张或几层层析板;操作过程要迅速等。在高效液相PITC柱前衍生法中,所有消耗品应一次性使用,包括进样瓶、进样瓶盖(包括瓶垫)、内插管,一次性注射器等,每次进样完毕后使用乙腈进行洗针,洗针瓶一次性使用等。虽然PITC柱子前衍生法的衍生溶液很稳定,但在后续实验中,作者发现也会发生微小变化,因此在衍生后应尽快测定,以减少误差。
综上所述,纸层析法和薄层层析法成本低,适合部分对精确度要求不高的含量测定。高效液相PITC柱前衍生法测定精确,成本较高,速度快,适合精确测定。然而,目前市场上仍缺乏一种快速又十分精确且价格低廉的L-苏氨酸检测方法,是本研究领域需要继续解决的课题。
